嵌合抗原受体（CAR）T细胞能有效治疗白血病，但持续的抗肿瘤反应可能因CAR-T细胞持续性不足而受阻。细胞毒性效应T细胞寿命短暂，建立具有记忆功能的CAR-T细胞以确保免疫监视至关重要。记忆T细胞依赖于细胞因子支持，其中IL7和IL7受体（IL7R）至关重要。然而，IL7R表面表达受IL7暴露的负调控。作者团队旨在通过为CAR-T细胞配备持续的IL7Rα信号来支持CAR-T细胞的持续性。工程化T细胞以持续分泌IL7或表达针对急性髓系白血病的IL7Rα-嵌合细胞因子受体（CCR），并表征了这些细胞类型。在CCR-T细胞中，经典下游信号转导被激活，IL7R激活。当与细胞毒性CAR共表达时，CCR和CAR的功能都得到了维持。我们设计了杂交型CAR-CCR，并注意到细胞内域的膜接近性对信号传递至关重要。这些数据表明细胞内源性细胞因子支持经典信号传导，功能可以通过独立表达IL7Rα域或将其整合到细胞毒性CAR中来提供，以用于抗癌治疗。
图1的内容展示了通过工程化CCR（嵌合细胞因子受体）或持续分泌IL7（sIL7）的人原代T细胞可以实现稳定的IL7信号通路激活。图中A部分展示了CCR和sIL7的结构以及它们被工程化进入细胞的方式。B部分显示了通过流式细胞术检测eGFP阳性和CCR表达来衡量T细胞的转导效率。C部分测量了在无细胞因子培养基中sIL7转导T细胞和对照细胞（G-o）上清液中IL7的浓度。D部分描述了健康供体和转导T细胞预激活（CD4和CD8）以及T细胞扩增第8天的T细胞亚群的免疫表型特征。E部分显示了在24小时细胞因子饥饿后以及IL7刺激30分钟后，不同细胞类型中STAT5磷酸化与总STAT5表达的比率，使用TR-FRET技术进行测量。F部分通过流式细胞术测量了CD127阳性细胞的百分比。G部分展示了每种类型的%CD127+细胞的代表性直方图。H部分为IL7R信号通路下游分子的质谱蛋白组学分析，包括总蛋白和磷酸位点的丰度。这些数据表明，通过CCR表达或持续sIL7激活的原代人T细胞可以有效地模拟经典的IL7R激活，并且这些改造能够刺激相似的下游信号传导。值得注意的是，长期分泌IL7的T细胞会下调CD127的表达，使它们对外界IL7治疗无响应。
图2中的内容展示了在免疫缺陷小鼠中，通过激活IL7信号通路来支持T细胞在体内的存活和增殖的实验结果。实验中，研究人员将表达CCR、分泌IL7（sIL7）或仅携带ffLuc报告基因的人类T细胞注入小鼠，并在21天内对一部分小鼠进行每日腹腔注射人IL7以模拟全身性IL7支持治疗。所有T细胞都被工程化以持续表达ffLuc，以便无创监测T细胞增殖。实验结果显示，所有激活IL7信号通路的小鼠组别中，移植的T细胞在实验期间持续扩张，其增殖速率显著快于对照组。在注射后第30天，通过监测外周血液中循环T细胞的数量，发现不同处理组之间存在差异。这些T细胞扩张模式在小鼠骨髓和脾脏中的T细胞数量上也有所反映。在注射分泌IL7的T细胞和积极接受腹腔IL7治疗（第1-21天）的小鼠的外周血液中可检测到循环IL7。CCR表达的T细胞保留了CD127表达，而分泌IL7或外源性IL7处理的细胞则失去了表达，这与之前的体外数据一致。有趣的是，随着腹腔注射IL7的清除（第30天），CD127表达恢复，突显了CD127调节的动态性。这些结果表明，IL7信号通路的激活对于T细胞在体内的存活和增殖至关重要。
图3中的内容展示了在T细胞中共同表达CD123靶向的嵌合抗原受体（CAR）和嵌合细胞因子受体（CCR）能够维持各自受体的功能。实验中，研究人员构建了第二代抗CD123 CAR，该受体包含一个与CD123独特表位结合的替代scFv（32716），CD28共刺激域和CD3ζ激活域，并在每个受体的N端添加了SNAP和Halo标签以便于在细胞表面进行独特检测。实验结果表明，CCR和CAR共同表达的T细胞（CCR+CAR+）的表面受体表达水平与单独表达CCR的T细胞相似，而单独表达CAR的T细胞表面受体表达水平更高。在细胞因子饥饿状态下，CCR+和CCR+CAR+ T细胞显示出相当的STAT5激活水平，且均高于单独表达CAR或未修饰的T细胞。使用固定化rhCD123刺激细胞时，仅表达CCR的细胞中STAT5激活水平显著增加。正如预期，只有在表达CAR的细胞中才能观察到抗原特异性的细胞因子分泌和细胞毒性活性。同时表达CCR和CAR的T细胞显示出相似的抗原特异性激活，并增强了对CD123阳性AML细胞系的细胞毒性。这些结果证实了CCR和CAR可以在T细胞中共表达而不相互干扰，保持各自的功能性。
图4中的内容展示了在人类急性髓系白血病（AML）异种移植模型中，共表达CCR和CD28.ζ CAR的T细胞相比于单独表达CD123靶向的细胞毒性CAR的T细胞，具有更好的抗肿瘤效果。实验中，NOD/SCIDγ小鼠被注射了表达ffLuc的CD123阳性AML细胞系MV-4-11，随后接受了不同组别的T细胞治疗。结果显示，共表达CAR和CCR的T细胞治疗组中有56%的小鼠实现了肿瘤的快速且持续的清除，而单独CAR治疗组中只有33%的小鼠实现了肿瘤清除。通过生物发光成像（BLI）监测白血病增殖，并进行对数转换处理数据后，发现工程化T细胞治疗组与未修饰T细胞对照组相比，白血病增殖有显著差异。此外，所有接受T细胞治疗的小鼠相较于对照组都有改善的生存期，其中CCR+CAR组的小鼠生存期最长，因为超过一半的小鼠在实验结束时疾病被治愈。这些结果表明，CCR的表达增强了CAR-T细胞针对CD123的体内抗肿瘤活性，并且CCR表达并不影响CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
图5中的内容展示了对嵌合细胞因子受体（CCR）的铰链结构进行修改以消除持续性信号（tonic signaling）并尝试提高对抗原特异性的研究结果。研究人员通过在CCR中引入不同的铰链结构，包括人类IgG4分子衍生的铰链、不含半胱氨酸的惰性铰链（IH）、一系列靠近膜的半胱氨酸（CP1、CP2和CP3）以及人类CD8α受体衍生的铰链，来比较它们对CCR表面表达和STAT5磷酸化激活的影响。结果显示，含有CD8α、CP1和IgG4铰链的CCR在未激活状态下的STAT5激活水平高于未修饰的T细胞，而将细胞置于rhCD123上可以增强这些含有铰链结构的CCR的STAT5磷酸化。通过流式细胞术和Western blot分析，研究人员证实了含有IgG4铰链的CCR具有自发的但可响应抗原的STAT5激活特性。这些结果表明，尽管改变了CCR的铰链结构，但并没有提高CCR对CD123抗原的特异性。
图6中的内容展示了在嵌合抗原受体（CAR）T细胞中，IL7Rα信号传导的功能性依赖于其在细胞膜附近的定位。研究人员比较了在CAR结构中加入IL7Rα域的T细胞与同时表达sIL7和CD28.ζ CAR的T细胞的功能。结果显示，IL7Rα域的信号传导在分泌IL7的CAR-T细胞和IL7Rα域靠近细胞膜的CAR-T细胞中明显，这两种T细胞类型的基础激活水平高于未修饰的T细胞。当IL7Rα域远离CD28域时，STAT5的磷酸化水平并未提高，而只有在IL7Rα域靠近细胞膜的IL7R.CD28.ζ T细胞中才观察到对抗原刺激的响应性。此外，所有经过工程化的T细胞在无细胞因子的培养基中，与未修饰的T细胞相比，表现出更高的代谢活性，包括更高的非糖酵解基础ECAR和在添加葡萄糖后的糖酵解能力，以及在sIL7和IL7R.CD28.ζ表达细胞中增加的最大呼吸率。所有表达CAR的T细胞在短期共培养试验中保持了针对CD123阳性靶细胞的特异性细胞毒性，尽管表达膜近端IL7Rα（IL7R.CD28.ζ）的T细胞在针对MV-4-11靶细胞时的短期细胞毒性有所降低。长期体外连续刺激试验显示，经过六次刺激后，对两种CD123阳性AML靶细胞系维持了细胞毒性。分泌IL7的构建在实验结束时保持了更快的细胞杀伤能力。总之，向细胞毒性CAR中添加IL7Rα域可以增加功能性，但这种功能性依赖于域的物理位置，靠近细胞膜是实现最佳IL7Rα下游活动的关键。
图7中的内容展示了在体内模型中评估分泌IL7和混合CCR-CAR T细胞作为AML治疗方法的效果。研究者选择了一个非治愈性的T细胞剂量，以确定IL7R下游激活的增加是否会促进输注T细胞持久的抗肿瘤活性。实验中，所有表达针对AML的细胞毒性CAR的T细胞即使在每只小鼠输注相对较低的2×10^6细胞剂量下也显示出抗肿瘤活性。通过BLI监测到的白血病增殖与外周血液中检测到的AML细胞数量相一致。外周血液中CD3+ T细胞的测量并没有显示任何T细胞治疗组在扩增或持久性上有显著差异。表达含有远端IL7Rα域的CAR（CD28.IL7R.ζ）的T细胞在体内对白血病的控制优于表达含有近端IL7Rα域的CAR（IL7R.CD28.ζ）和分泌IL7的CAR-T细胞。所有经过工程化的T细胞治疗组相比于未修饰的细胞或未治疗的小鼠都有改善的总体生存期。因此，尽管在分泌IL7的CAR-T细胞和含有膜近端IL7Rα域的CAR-T细胞中激活了IL7R途径，但表达CD28-膜近端CAR的细胞具有更强的抗肿瘤活性，从而在人类AML小鼠模型中导致了最好的生存结果。
综合来看，本文研究了通过嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗白血病时，细胞内源性IL7受体α（IL7Rα）信号对于增强T细胞持续性和抗肿瘤反应的重要性。研究发现，与传统的外源性IL7激活相比，通过工程化手段在CAR-T细胞中引入IL7Rα信号可以更好地维持T细胞的抗原特异性细胞毒性和扩增。研究还探索了不同CCR-CAR结构对T细胞功能的影响，发现IL7Rα信号传导的效率依赖于其在细胞膜上的接近程度。在体内模型中，虽然IL7R信号的激活在某些情况下可以提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性，但表达具有膜近端CD28结构域的CAR的T细胞显示出更强的抗肿瘤效果和更好的生存率。这些发现为CAR-T细胞疗法的临床发展提供了有价值的策略，特别是在提高治疗效果和减少潜在毒性方面。
