文献阅读
一篇来自礼来的研究文献，本篇文献主要对具有不同特征的IgG亚类进行了系统性的评估和研究，评估的内容包括中国仓鼠卵巢细胞生产力、宿主细胞蛋白去除效率、保守的 N297 Fc 位点的 N 连接聚糖结构、热应力条件或在冷藏温度下长期储存下的高浓度溶液的外观以及聚集体、片段、电荷变体变化和翻译后修饰等。
背景信息
本研究中使用的 12 种 mAb ，简而言之，三个不相关的可变区（Fv-A、Fv-B 和 Fv-C）分别克隆到IgG1、IgG1 L234A、L235E、G237A、A330S、 P331S (IgG1EN), IgG2 和IgG4 S228P, L234A, L235A (IgG4PAA)中，如表 1 所列。
为 12 种 mAb 中的每一种生成了 CHO 批量稳定细胞系，并在摇瓶中以 1 L 规模生产。结果总结如下：
1 抗体表达及其批次 CHO 稳定细胞系生产力的描述
在三个系列的 mAb 中，Fv-A 系列表现出最高表达滴度，范围为 5.0 g/L 至 7.1 g/L，而 Fv-B 系列和Fv- C 系列显示滴度在 3.4–4.9 g/L 范围内。通过比较各个亚类，IgG1 和 IgG1EN mAb 的表达滴度趋势略高于相应的 IgG2 和 IgG4PAA mAb。
2 纯化和残留 HCP
通过标准的两步纯化工艺，即蛋白 A 随后进行阳离子交换层析 (CEX)，mAb 表现出不同水平的单体百分比。对于带有 Fv-A 的 mAb，无论 IgG 亚类如何，所有 mAb 的单体产量均高于 99%。对于具有 Fv-B 的 mAb，其单体百分比变化范围较小（98.0–99.3%），而所有四种具有 Fv-C 的 mAb 的纯度均在 90% 左右。
采用液相色谱质谱（LC-MS）方法测定抗体样品中残留的HCP。蛋白 A/CEX 纯化后，所有三个系列中 IgG4PAA 的残留 HCP 水平最高，而 IgG2 的 HCP 水平等于或低于IgG1 和 IgG1EN。 Fv-A 系列在每个亚类中表现出最高的 HCP 水平，而 Fv-B 和Fv-C mAb 之间的水平相对相似。
3 Fc-糖基化谱
对连接到 N297的保守 N 连接聚糖的结构进行了评估，发现 11 种纯化的单克隆抗体在很大程度上相似。然而，IgG4 亚类的 %G0F 升高，而IgG2 和 IgG4 亚类的 %G1F 趋于降低。相对于 IgG1，IgG1EN 的 G1F 增加 6-10%，G2F 适度增加 2%，同时 %G0 和 %G0F 相应减少。
4 应激条件下和长期冷藏下的物理化学稳定性
为了比较这些 mAb 的物理化学稳定性，将除 IgG2-A 之外的所有 IgG 分子在由 5 mM L-组氨酸（pH 6）、260 mM 甘露醇和 0.03%（w/v) 聚山梨酯 80组成的通用制剂缓冲基质中浓缩至约 90 mg/mL。将样品在 5°C、25°C 和 35°C 下保存 1 个月至 30 个月，以评估其在这些条件下的理化稳定性，包括聚集生长、断裂、电荷变体分布变化、和翻译后修饰（PTM）。结果描述如下。监测蛋白质浓度和溶液pH值并观察到随时间的最小变化。
4.1 外观
浓缩后立即以及在 25°C 和 35°C 孵育 1 个月后对浓缩样品进行目视检查。
考虑到相同的可变区，IgG2 和 IgG4PAA mAb 比 IgG1 和 IgG1EN mAb 表现出更多的乳光。还可以看出可变区起着重要作用，乳光排序为Fv-B系列> Fv-C系列> Fv-A系列。尽管每个系列内的亚类之间在视觉乳光方面存在差异，但这并没有表现出显著的蛋白质含量损失。当在 5°C 保存 2.5 年时，所有样品均保持其原始蛋白质浓度的约 95%。
4.2 基于SEC的聚集体变化
总体而言，本研究中的所有 mAb 在测试条件下都是稳定的，并且不同 IgG 亚类之间的聚集体增长没有一致的趋势。
4.3 基于SEC的片段水平
结果显示，在 25°C 或 35°C 热应激 1 个月后，片段增长表现出对可变结构域的明显依赖性，其中 IgG1-B 和 IgG1EN-B 比Fv-A 或 Fv-C 中的对应物表现出更明显的增长。然而，在5°C 储存 30 个月后，可变结构域对片段的影响就不那么明显了，无论可变结构域如何，每个 IgG 亚类都显示出相似的片段增长水平。
4.4 iCE 改变电荷变体
使用成像毛细管电泳 (iCE) 分析所有 11 种 mAb 的电荷变体变化。
在 35°C 下进行 1 个月的热应激后，所有三个 mAb 系列中的 IgG1EN 和 IgG4PAA mAb 均表现出与 IgG1 和 IgG2 mAb (2–6.4%) 相比主峰显著损失 (10.4–15.2%)。在 5°C 下孵育 30 个月后，IgG 亚类之间的电荷变异差异总体较小，但与较高温度下的趋势相同。虽然所有 Fv-A、所有 Fv-C 和大多数Fv-B mAb 均显示酸性物质显著增加（无论亚类如何），但 IgG4PAA-B 表现出碱性物质的增加量大于酸性物质的增加量。
4.5 通过 LC-MS 和肽图分析 Fc 上的PTM 热点
在 Fc 结构域中鉴定出 6 个潜在的脱氨位点：N315、N325、N361、N384、N389 和 N434，这些位点在评估的亚类中是保守的。通过肽图分析获得的这些位点的脱酰胺水平变化：
结果显示，在 25°C 下，3 个月后，所有 mAb 的 Fc 结构域中的总脱酰胺水平增加了 4% 至 10%。在 6 个潜在脱酰胺位点中，N325、N384 和 N389 表现出最明显的增加，而 N315、N361 和 N434 在 3 个月 25°C 稳定性样品中显示脱酰胺水平增加 <0.5%。
甲硫氨酸氧化水平的变化如下图：
还检测到其他 PTM，例如 Asp 残基的异构化以及 Asn 或Asp 残基的琥珀酰亚胺形成。这些 PTM 的含量较低（压力样品中的总变化 ≤ 2%，5°C 长期储存样品中的总变化 <1%），并且未进行进一步研究。
总结
本篇文献对来自三组不相关可变区的12 种单克隆抗体进行了系统研究，每一种都克隆到 IgG1（效应功能减弱的 IgG1 变体）、IgG2 和FcγR 相互作用进一步减少的稳定化 IgG4 变体中，以评估IgG 的影响在通用配方缓冲基质中的可生产性和高浓度稳定性。评估包括中国仓鼠卵巢细胞生产力、宿主细胞蛋白去除效率、保守的 N297 Fc 位点的 N 连接聚糖结构、热应力条件或在冷藏温度下长期储存下的高浓度溶液的外观以及聚集体、片段、电荷变体变化和翻译后修饰。结果阐明了所有 IgG 亚类共有的分子属性，以及某些 Fc 结构域所独有的分子属性，为 IgG 亚类对抗体可生产性和稳定性的影响提供了新的见解。这些知识可用于在治疗性抗体的IgG 子类选择上做出平衡的决策，并有助于加速其产品开发过程。
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