文献阅读
最近学到一篇关于哺乳动物细胞“单克隆”性的综述文献，讨论了单克隆的目前做法，以及监管视角和监管讨论，很有指导意义，全文翻译，供大家学习~~
翻译中文版，可添加星辰君微信号（15053131463）索取~~
摘要
最近，人们越来越关注用于生产重组DNA 来源生物制药的哺乳动物生产细胞系的克隆来源的监管重点和相对重要性。这种兴趣引发了监管机构和行业之间关于如何评估该主题及其在新生物制药开发中发挥的作用的持续讨论。作者在本文中描述到，生产细胞系的克隆来源是对产品质量具有潜在影响的一个因素，因此不应单独考虑，而应结合支持监管申请获批所需的控制策略的所有要素一起考虑。本文提供了在生物制药产品的生命周期中如何看待细胞库的克隆来源及克隆变异的考虑因素。
1. 介绍
最近，人们非常关注 [1-4] 用于生产重组 DNA 生物制药的哺乳动物生产细胞系的克隆来源的监管重点和科学实践。这种兴趣引发了监管机构和受监管行业之间关于如何评估这一主题的持续讨论。克隆来源的评估可以被视为独立的考虑因素，也可以被视为了解生产过程中风险的一个方面。作者在此描述了生产细胞系的克隆来源是对工艺一致性和/或产品质量具有潜在影响的一个因素，因此不应单独考虑，而应在评估支持上市许可的必要的控制策略的背景下考虑。。此外，作者试图将这一想法进一步扩展到其逻辑性结论：由于克隆来源有可能影响生产过程以及产品的关键质量属性（CQA），因此应提供足够的细节来评估它是如何执行的。此外，当此类克隆方法被认为对产品质量存在高风险时（例如，科学实践不那么严格，包括文件记录），则必须通过增强控制策略来减轻由此产生的风险。本文还描述了支持有意使用非克隆细胞系进行毒理学、非临床和首次人类研究的最新工作。最后，重点讨论了有关克隆来源对细胞系稳定性的潜在影响，这个尚未解答的重要问题。
2.1.目前的做法
近几十年来，使用哺乳动物细胞系已成为生产商业化重组蛋白治疗产品的最常见平台[5]。其他细胞基质也是潜在可行的选择，并且已在一定程度上使用，例如细菌、酵母、植物和昆虫细胞系。尽管与其中一些替代系统相比，产量相对较低且开发时间较慢，但哺乳动物细胞系（特别是中国仓鼠卵巢 [CHO]，以及一定程度的 NS0）由于其独特的特性，成为生产相对大量的正确折叠、组装和适当翻译后修饰的产品的最常选择的宿主细胞系。此外，产品开发人员选择 CHO 细胞而非其他哺乳动物细胞系，因为它们具有永久性以及在培养物中作为单细胞悬浮生长的能力，因而在细胞系开发过程中更容易操作 [6]。此外，与 CHO 细胞系相关的其他几个微妙特征和细微差别使其成为商业细胞系的理想选择。这些包括：直接适应化学成分明确、控制良好且无血清的培养基，使其易于进行工艺放大，对病毒感染的敏感性相对较低，以及相对成熟的基因选择和扩增平台，有助于选择和筛选初始“克隆”[7]。
因此，最近的研究和开发活动探索了一些策略，使这些细胞系能够在开发的所有阶段提高其生产力[8]。
初始 CHO 细胞系，所有当前商业 CHO 细胞系均源自该细胞系，是由近亲繁殖的雌性中国仓鼠的卵巢产生的。作为一种永生细胞系，它本质上是不稳定的，并产生了基因型和表型多样化的家族，这通过许多单核苷酸多态性 (SNP)、拷贝数变异和核型反映出来。这导致一些作者将 CHO 宿主细胞系描述为“准物种”[9]。最近对 CHO 基因组的研究可能为细胞系工程提供信息，也证明了不同 CHO 细胞谱系和基因组图谱之间显著的染色体异质性 [10-12]。此外，宿主细胞系开发工作经常引入额外的遗传、环境或化学因素，旨在优化所需的生产细胞属性。此外，这些因素可能会越来越多地使用选择压力、细胞组学和生长动力学，当这些因素随后与细胞筛选和细胞培养操作期间对细胞的要求相结合时，可能会增加商业细胞系的生物反应器的潜在性能波动。
尽管技术迅速发展，但细胞系开发最常见的行业实践仍然相对不变：递送操纵基因的质粒，然后将质粒随机整合到基因组中。质粒通常有助于筛选，通过克服亲本细胞系固有的缺陷，从而提高选择和存活率。通常，二氢叶酸还原酶（DHFR）或谷氨酰胺合成酶（GS）用作选择剂。最近的发展表明，一些选择方法，特别是使用 DHFR 和甲氨蝶呤的扩增方法，在进一步培养时可能特别容易受到转基因不稳定的影响[13]。
典型细胞库的构建通常包括“克隆”步骤。此步骤不仅有助于识别稳定、高产的细胞群，而且还执行本出版文献重点关注的关键功能：在细胞库开始时创建单细胞前体或祖细胞，以最大限度地减少细胞库异质性。生产细胞系的筛选和细胞库的建立仍然是上游细胞系和工艺开发的主要瓶颈。因此，人们对开发和完善用于选择高表达细胞系的方法感兴趣[8,14]。尽管技术取得了进步，有限稀释作为分离单个前体细胞最古老、最耗时的方法之一，仍然经常用于至少一轮、偶尔用于所有轮次的克隆来源细胞系的选择和生成[15 ]。该方法严格依赖于概率方法，其中通过稀释实现了极低的细胞浓度，随后的平板接种导致每孔 < < 1 个细胞，然后从每个单独的孔进行扩增。该方法可以提供相对较高的“克隆来源”（即从单个原始细胞来源）的统计概率，但其缺点是耗时、缓慢且通量低。通常进行显微镜评估是为了提供单个细胞的视觉确认。在此方法中，必须在表征之前扩增细胞系。此过程可能会将真正的筛选限制在几百个选择范围内，因此可能导致无法识别出更理想的候选。
流式细胞术成功地改编自一种研究工具，可以允许根据细胞表面特征选择细胞系，并已用于基于与抗体的特异性相互作用来选择细胞。该方法可以筛选数百万而不是几百个潜在细胞，并且可以建立和使用严格的选择标准，以进一步支持将细胞放置在多孔板系统中的技术。此外，该策略为感兴趣的细胞系的识别策略提供了巨大的多功能性，包括标记、偶联物或报告基因的使用。然而，选择过程本身会给细胞带来压力，并可能会减少生长[16]。
另一组在细胞系来源和选择的进步中发挥重要作用的技术是自动克隆筛选和选择系统，例如 Clonepix 和 CellCelector [17-20]。这些系统将细胞固定在半固体培养基基质内。检测抗体在所得菌落附近提供的荧光标识符。此类系统在选择之前扩增克隆所需的时间相对较长，并且对用于选择的抗体的评估和控制带来限制。通常，这些技术可用于初步筛选，作为剔除不良生产者的机制，而不是用于识别最终候选者。这种初始筛选方法源于半固体基质内和液体基质内的行为之间潜在的有限相关性，以及基于缓冲液修改进行进一步细胞系适应的潜在需要。
最后，成像系统经常与其他克隆工具结合使用，无论是有限稀释、FACS、ClonePix 等，实时提供技术“成功”的视觉评估。因此，从开发的角度来看，成像技术提供了一种有吸引力的方式来提供支持数据，以确保生产细胞系的克隆来源，而无需额外的实验室工作。然而，它们的实用性（和“准确性”）可能会受到校准、焦点、照明、焦深和/或分辨率问题等因素的影响。此外，这些成像系统还提出了其他非基于光学的考虑因素，例如细胞位于孔底部的概率，以及在成像期间将细胞定位在孔内的概率。
2.2.克隆来源的统计评价的探索
最近对评估重组细胞系克隆来源的保证的统计和概率方法的观点试图探讨估计单克隆性的准确性水平。单克隆性的原始统计评估源自于 Coller 和 Coller [21] 提出的简化无限级数。Zhou等人最近的工作讨论了泊松分布的使用，并强调了它在存在选择压力的情况下低估了单克隆性的概率[22]。这些实验对来自单轮有限稀释的细胞系遵循泊松分布作为单克隆性估计的推论提出了挑战[23,24]。还有一些人建议在单轮有限稀释后使用置信区间来评估单克隆性，而不是使用点估计[23]。这种方法的数据收集需要获得空孔的数量和孔的总数以进行评估。置信区间的使用说明了在单轮有限稀释后确保单克隆性所固有的不确定性水平。
人们对使用新的选择平台来评估克隆来源的可能性的潜力产生了浓厚的兴趣。例如，荧光激活细胞分选（FACS），如果给出与所进行的分析相关的足够信息，例如细胞如何分选的详细描述、过程参数、图像、分析人员的培训，已被提议可提供分离单个细胞大于98% 的概率 [25]。对于固体培养基选择平台，申办者对单克隆选择的概率提供了截然不同的估计。这并不奇怪，因为克隆挑取成功的可能性（以及扩增后的单克隆性）可能很大程度上受到选择时菌落大小的影响。事实上，一个菌落与其他潜在菌落的相对距离，以及在铺板时选择的铺板密度已被认为在该技术的可行性中发挥着重要作用[26]。
2.3.有意使用非克隆来源细胞系
随着新技术对我们用于支持用于药物开发的单克隆来源细胞系的开发方法的影响，提出了完全不同的方法来开发用于早期药物开发的细胞库。例如，最近的多个行业出版文章建议使用稳定的细胞池，这些细胞池是通过对稳定表达转基因的非单克隆细胞池施加选择性压力而开发的，作为重组表达平台技术（例如DHFR）的一部分。这与开发单克隆来源细胞系作为在早期药物开发阶段快速部署药物产品的机制形成鲜明对比，用于毒理学和非临床研究，甚至可能用于首次人体研究 [27,28]。对两种不同的分别来源自小型稳定池（迷你池）和克隆细胞系的治疗性抗体候选物进行的比较研究，评估了在 14 天补料分批培养中的细胞培养性能，包括生长状况、生产力、活细胞密度和活力。迷你池细胞产生的原液的产品质量属性与来自同一迷你池（在某些情况下）的克隆来源生产细胞系产生的原液相似，但在某些情况下在糖基化、电荷变体和的生长动力学方面存在一些差异。在观察到质量属性差异的情况下，研究作者讨论了如何减少或消除观察到的产品质量差异，同时考虑对产品性能的潜在影响，得出的替代方法是要么通过筛选来自迷你池的其他克隆细胞系，要么收紧工艺参数。本讨论强调了使用迷你池进行毒理学和首次人体研究的可行性[29]。其他人还建议使用细胞池进行毒理学研究，然后从毒理学研究中使用的特定细胞池中进行单细胞克隆。这种方法将毒理学研究中使用的细胞池与根据产品质量属性从给定细胞池中选择的克隆来源生产细胞系联系起来[30]。
关于用于创建主细胞库的细胞系的单克隆来源，存在科学和监管方面的考虑。尽管没有任何一项监管指南明确说明需要拥有明显的“单克隆来源”细胞系，但多个指南文件都提到了这一普遍期望，并强调其作为基本期望。这些包括但不限于：
ICH Q5D 用于生产生物技术/生物产品的细胞基质的来源和表征，“对于重组产品，细胞基质是从单细胞祖细胞克隆而来的包含目的序列的转染细胞”[31]，
US FDA 在人用单克隆抗体产品的生产和检测中应考虑的要点中指出，“MCB 被定义为源自单一组织或细胞的具有均匀成分的细胞集合”[32]，以及
EMA/CHMP 指南[ 33]其中指出“用于生产单克隆抗体的细胞基质应该是通过重组DNA和/或其他合适技术开发的稳定且连续的单克隆细胞系”。
世界卫生组织最近的一份技术报告[34] 对该主题提供了更详细的信息。尽管他们确实指出“对于通过重组质粒 DNA 技术转染获得的蛋白质，单轮完整记录的克隆就足够了”，并且还指出，或者除了有限的稀释步骤之外，克隆程序还可以包括“更新的克隆技术，例如单细胞分选和排列或从稀释种子到半固体培养基中的菌落挑选”。
可以理解的是，这些建议确实反映了单克隆过程的科学现实，即它“不一定保证源自单细胞”，其部分基础是克隆过程应“完整记录，包括成像技术和或适当的统计技术的详细信息”。因此，尽管需要达成共识来澄清具体期望是什么（例如，多少轮有限稀释就足够了），但细胞库创建方式及其支持数据的概念上似乎不存在不一致之处，这很重要。
执行单克隆步骤的选择并不仅限于监管期望，而且还受到科学必要性的驱动。事实上，主要目的是区分和最终鉴定具有稳定生长特征、产生大量蛋白质的个体细胞群，产生的蛋白质具有独特特征和可确保产品安全性和有效性的 CQA。事实上，确定这个“最佳点”是一种相对罕见的现象，因为高产候选者只占大量相对选择的一小部分[14]。此外，人们普遍认为，额外的细胞传代最终对应于低蛋白质生产或非蛋白质生产克隆的速率增加，因为高产量克隆的生长速度较低，这与代谢能量的消耗和蛋白质生产有关增长[35]。事实上，这可能会给选择合适的细胞系进行开发带来难以置信的困难，因为一些产品，例如，生物类似药开发需要针对基于表征的所得蛋白质的特定的关键质量属性（CQA）范围，进一步限制其适当属性的范围。
如下图 1 所示，假设的细胞库反映了监管部门对单克隆来源步骤的关注基础。图中所示的是左侧 (A) 的非单克隆来源细胞库和右侧 (B) 的单克隆来源细胞库，其中非单克隆来源细胞库是通过在细胞库的开发过程中每孔无意接种两个细胞而生成的。y 轴描绘了对细胞表型敏感的特定属性（例如，CQA），反映了单克隆来源细胞库的单细胞分离在时间零（y 轴上）的单个值和非单克隆来源的细胞库的两个值。x 轴表示时间。在培养过程中，发生了表型漂移，影响收获时的遗传群体平均值，导致该群体的给定属性所具有的平均值（用蓝色方块表示）和范围（用橙色箭头表示）。重要的是，尽管非单克隆来源的细胞库在收获时可能会产生与单克隆来源的细胞库相同的 CQA 平均值，但其在克隆过程中不同的起始点可能会导致一个或多个 CQA 的更大变异性，并可能导致更高的漂移敏感性、转变和生产寿命期间不可预见的选择压力，由蓝色箭头所示的生产变异表示。细胞库内的此类变异可能会对产品性能产生可观察到的（如果可量化）的影响。
图 1. 非故意非单隆来源的细胞库的变异性以及对生产变化的潜在影响（橙色箭头描绘了收获时的值范围，蓝色方块描绘了范围平均值）。y 轴上的时间0反映了单细胞分离。
行业白皮书 [4] 提供的一个相反考虑是，“克隆性”的明确证明永远不可能真正实现（无论科学实践如何，都会残留一些非单克隆来源的残留，尽管概率很小），并且控制策略开发活动应成为重点，以确保产品质量。然而，在这种情况下创建最终控制策略可能具有挑战性，特别是当寻求利用开发活动中获得的工艺能力和知识来支持控制策略灵活性或减少执行检测和建立工艺控制参数的监管承诺（或减少报告变更时的要求）时，细胞库性能的稳定性和一致性是至关重要的。
众所周知，控制策略，特别是分析检测确实在确保 CQA 随时间推移的漂移最小化方面发挥着关键作用。然而，由于几个额外的关键原因，建立一个不关心细胞库的单克隆来源和关于如何创建细胞库的足够信息的控制策略本质上是有问题的。首先，虽然检测可能成功地实时识别质量属性的变化或漂移，但识别漂移与控制漂移不同，并且对于每个批次的所有 CQA 来说可能是不可能的。其次，质量体系不一定能够很好地配置来将“单克隆来源”识别为在一个或多个质量属性中观察到的变化的根本原因。作为一个假设的例子，如果一批新的培养基由于细胞系的选择压力而导致变化，OOS 调查可能会通过提出问题“有什么不同？”来开始对已确认的非典型结果的调查。事实上，鉴于本例中的细胞库本身可能没有变化，因此很可能从一开始就将其排除在根本原因之外。
最后，人们承认检测策略确实在长期保持质量方面发挥着不可或缺的作用。然而，通过产品检测证明“不合适”的细胞系本身可能并不能保证细胞库能够支持产品的生命周期。事实上，细胞库必须在新兴的 21 世纪生物技术背景下确保产品质量，即生产现实日益复杂，通常具有不同的生产规模和可变的生产工艺、原材料和地理位置。鉴于细胞库可能面临未来生产变化的可能性，例如扩大规模或引入灌流培养，培养周期较长，影响和风险难以预测，这一点至关重要。工业界的大量工作表明，其他因素可能会导致潜在的异质性，从而对试图证明良好控制和高度可能的单克隆来源的科学和实践必要性提出了疑问。最近的工作已经检查了从单克隆来源细胞系扩增的单细胞固有的异质性[36]，并证明了生产力和产品质量方面的显著表型变异。Scarcelli 等人最近的工作[37]包括对单克隆来源的细胞系进行亚克隆，以评估序列异质性的潜在起源。这项工作不仅证实了细胞库内预期的表型变异性，而且强烈表明观察到的序列异质性可能源自与培养后克隆相关的事件。为了支持这种固有的遗传变动，He 和 Frye [38] 提出了一种基于风险的重组 CHO 细胞系转基因表征策略，作为一种风险缓解方法。He等人的另一项研究[39]分析了单个重组CHO细胞中的转基因拷贝数分布，发现随着时间的推移保持高水平生产力的细胞系比表现出生产力损失的细胞系表现出随着时间的推移更一致和同质的转基因拷贝数分布。正在进行额外的努力[40]来探索表观遗传因素的作用，包括胞嘧啶甲基化及其在细胞系行为中的相对作用。最后，Vcelar [41] 的工作证明核型稳定性可能不会影响细胞系的性能。
然而，即使是单克隆来源的细胞系也具有巨大的异质性（或克隆变异），并且非单克隆来源的细胞库在某些情况下可以生产其 CQA 与单克隆来源细胞系生产的药物可比的药物，但这一证明未能解决关键的未解决问题。此外，有必要回答这些问题，以便将这些结果外推到更宽泛的最终结果，使围绕“单克隆来源”的担忧变得无关紧要：尽管单克隆来源的细胞系具有异质性，但没有必要细胞库的单克隆来源。需要解决的问题示例包括：
来自非单克隆来源细胞系的细胞库，如果在生产过程中无意引入额外的单细胞（具有不同的生产特性）而生成的，是否可能导致更大的批次间差异？
来自非单克隆来源细胞系的细胞库，如果在生成过程中无意引入额外的单细胞（具有不同的生产特性）而生成的，是否可能导致生产条件的微小变化导致一种或多种质量属性漂移/转变的可能性更大？
如果前两个问题中的任何一个的答案为“是”，那么早期开发中是否存在可以潜在解决风险的筛选或表征技术？
4. 监管讨论
其次，尽管我们确实承认在早期工艺开发（以及工艺验证）期间有可能检测到与细胞系相关的问题并评估其风险，但此类活动仅反映了一个简短的事实，即不适合识别可能（例如，CQA 中的意外变化）可能会在产品的生命周期中发生的风险。此外，值得注意的是，21 世纪生产现实加快了的时间表和突破性疗法的指定，可能会进一步降低识别与宿主细胞系克隆来源相关问题的活动的可能性。具体来说，这种压缩的产品开发时间不仅导致 CMC 开发活动的倒退，而且还可能减少和简化“标准”开发计划中可能发生的一些工艺开发活动。因此，与快速产品开发计划固有的 CMC 开发时间缩短相关的风险管理是质量风险管理框架关注的一个领域。
此外，对于维持宿主细胞系稳定性和最小化遗传漂移所需的细胞培养环境条件知之甚少，并且直到最近才进行讨论[9]。至关重要的是，尽量减少这种异质性的建议，包括尽量减少生长限制（选择性）条件，以及在所有生产环境中采用一致的生物反应器设计，在很大程度上与现代生物制药生产的性质不兼容。
第三，人们认识到，监管重点应放在确保所管理产品的质量上，并确保患者能够持续获得医疗必需的药物（例如，降低药物短缺的风险）。此外，确定主细胞库反映“单克隆来源群体”的概率以及相应风险的性质并不是凭空做出的决定，而是在发起人总体控制策略的背景下考虑。
由于产品使用的单克隆来源方法以及相应的文件很重要，因此监管机构应要求提供足够的详细信息来评估与单克隆来源相关的过程和程序。数据（例如支持细胞库生成过程中发生的情况的图像）应可供审查和考虑。最后，细胞库开发（包括驯化）、储存、处理程序和这些程序的控制的步骤，或可能影响细胞库的储存或操作的变化，是潜在高风险的关键点。当原始细胞库是从无意的非单克隆细胞“库”扩展而来的情况下尤其如此，这些非单克隆细胞反映了不同的生产特征并表达的蛋白质反映了略有不同的质量属性。此外，在缺乏可靠且有据可查的程序的情况下，在产品的常规生产和整个产品生命周期中使用非克隆细胞系存在相关风险。因此，控制策略需要在监管文件中包含和记录额外的要素，以反映这一现实。
为此，出现了两个潜在的考虑因素：（1）如果没有足够的描述和详细信息来创建细胞库，就不可能评估与非单克隆来源相关的残留风险，以及（2）在控制不足的情况下如果已记录或包含在细胞库来源过程中，则支持许可所需的最终控制策略将需要解决相关风险。
5. 未来展望与结论
在此，我们提供了描述哺乳动物细胞系“单克隆来源”的讨论、基本原理和背景：影响生物药品可重复生产、其 CQA 控制以及最终将细胞库转化为产品的能力的一个因素被世界各地的患者使用。事实上，未来的技术进步可能会使这一领域的讨论变得毫无意义，因为与当前的随机整合方法相比，新技术有可能大幅改善遗传同质性。关于形成培养中哺乳动物细胞的动态和行为的细胞库特征、工艺参数和工艺控制的复杂相互作用的附加信息很可能导致风险评估和控制策略，这些策略在避免意外的选择压力或单克隆率增加方面要有效得多。随着时间的推移，导致产品质量发生一项或多项变化的变异。然而，生产细胞系的单克隆来源是对可重复生产和产品质量属性具有真实和有形潜在影响的因素。对于应用评估表明单克隆来源导致残留不确定性的情况，可以提出控制策略的额外要素，以帮助长期致力于为患者提供高质量药物。
为细胞系来源选择的步骤和支持它们的技术可以有所不同，只要它们在科学上是合理的，并且有足够的信息支持最终的控制策略确保产品的安全性和有效性。虽然行业和监管机构继续寻求和识别旨在缩短新产品推向市场时间的机会，但必须证明的是对相关风险的清晰理解和全面评估，以便对早期开发结果获得一定程度的信心是准确的，并且产品质量不太可能受到新提议方法的不利影响。事实上，关于这个主题的讨论对于从科学角度理解对产品质量的影响至关重要，即使进一步的开发工作[43-46]表明单克隆来源即使对于商业化来说也不是那么重要的问题。因此，只要考虑代表一系列变量（包括不同的细胞基质、平台、操作和生产变化）的严格而全面的数据，持续进行的工艺和产品质量研究，考虑到单克隆来源的关键因素，将有助于推动该领域的发展。
星辰纯视界小程序平台
