文献阅读
作者在优化GSCHO下表的Fc融合蛋白表达滴度过程中，发现伴随着表达滴度的提高，蛋白的唾液酸化水平下降。通过实验和分析显示主要原因是蛋白半乳糖基化的缺乏导致。本篇文献对这一现象进行了研究和验证，从而阐明了半乳糖基化在蛋白唾液酸化中的重要作用。
表达滴度增加，但是唾液酸化降低
在使用平台补料分批培养过程中， Fc融合蛋白的最终滴度为 0.31 g/L。氨基酸分析显示，精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和苏氨酸在培养结束时几乎耗尽。经过几轮补料培养基优化，比蛋白生产率（Qp）提高到3.6倍，最终效价提高了四倍。
然而，唾液酸化水平下降了 31.1%（图 2）。
原始工艺和优化工艺之间的其他质量属性（SDS-PAGE、HIC 和生物活性）相似。两种工艺的主要参数如表1所示。
为了找出当前系统中蛋白质唾液酸化减少的原因，研究了唾液酸含量减少的潜在机制。
测量了细胞外唾液酸酶的活性。图3显示原始工艺和优化工艺之间的唾液酸酶活性没有显著差异。因此，优化过程中唾液酸部分水平的降低并不是由于细胞外唾液酸酶活性所致。
蛋白质唾液酸化整体丧失的另一个可能原因可能是培养环境中缺乏唾液酸前体。为了增加唾液酸化，向培养物中添加 N-乙酰甘露糖胺 (ManNAc) 和胞苷。在第 5 天将浓缩的 ManNAc 和胞苷送入优化工艺，最终浓度分别为 20 和 10 mmol/L。图4显示，添加ManNAc和胞苷时，第6天、第9天和第12天唾液酸含量没有统计学差异。事实上，添加ManNAc和胞苷并没有显著提高蛋白质唾液酸含量，这意味着细胞培养物中的唾液酸库是足够的。
为了深入了解当前系统中唾液酸化的减少，分析了蛋白质的聚糖（表 2）。
寡糖分析表明，工艺优化后，唾液酸化聚糖从 41.4% 下降到 19.0%（表 3）。有趣的是，不含半乳糖的 N-聚糖从原始工艺的 23.1% 显着增加到优化工艺的 47.4%（表 3），表明没有足够的半乳糖基化位点用于添加唾液酸。
由于唾液酸转移酶在唾液酸化过程中将唾液酸转移到聚糖底物（即半乳糖基化聚糖），因此由于缺乏用于添加唾液酸的半乳糖位点，半乳糖基化的减少似乎可能是唾液酸化中的有限步骤（图5）。因此，可以通过增加Fc融合蛋白的半乳糖基化水平来潜在地改善唾液酸化。
为了研究我们的假设，第一个尝试是通过添加半乳糖基化过程的关键前体（例如半乳糖）来增加半乳糖基化。进行了几个实验来检验这个假设。培养物在 2 L 生物反应器中生长，第 5 天将浓缩 D-半乳糖加入优化工艺中，终浓度为 0、10、20 和 40 mmol/L。测试细胞生长、活力、代谢和蛋白质产量。
如图6所示，半乳糖补料对活细胞密度、活力、细胞代谢和Fc融合蛋白产生影响很小。仅 40 mM 半乳糖即可抑制葡萄糖消耗率。最终葡萄糖浓度从 0 mM 半乳糖时的 4.4 g/L 增加到 20 mM 半乳糖时的 4.7 g/L；40 mM 半乳糖浓度为 5.4 g/L。还分析了不同过程的半乳糖浓度（图7）。
结果显示，10 mM 补料条件下的半乳糖在第 10 天完全消耗。在生物反应器中发现，直至 20 mM 半乳糖补料条件下，残留半乳糖水平略有增加；然而，86% 的半乳糖仍然被消耗掉。在 40 mM 半乳糖喂养条件下观察到更大量的半乳糖积累。
采用NP-HPLC法检测添加半乳糖对Fc融合蛋白糖基化亚型分布的影响。表3总结了含有半乳糖和唾液酸的聚糖的百分比。与添加 0 mM 半乳糖相比，添加 20 和10 mM 半乳糖的 2-半乳糖聚糖分别增加了 1.71 和 1.36 倍。然而，1-半乳糖聚糖的百分比没有观察到显着变化。因此，我们得出结论，补充半乳糖导致的半乳糖基化总体增加主要是由于 2-半乳糖聚糖的增加。如表3所示，当补充10 mM半乳糖时，蛋白质的唾液酸化聚糖从19.0%增加到28.8%；补充 20 mM 半乳糖后，进一步提高至 39.3%。然而，20 mM 半乳糖和40 mM 半乳糖补充剂之间没有显着差异。在细胞培养过程中补充 20 mM 半乳糖时，聚糖中半乳糖的改善也转化为唾液酸化聚糖的改善。
为了验证这种转化是否提高了总唾液酸含量，我们进行了总唾液酸含量分析。
结果发现，补充10、20和40倍半乳糖时，唾液酸含量分别提高到1.24、1.44和1.45倍。因此，通过在优化工艺中添加20或40 mM半乳糖可以提高唾液酸含量。
使用 20 mM 半乳糖补料对多次 200 L 中试规模运行进行了评估。运行性能与 2 L 规模的运行性能相似。此外，较大规模的糖基化谱（表 2）和蛋白质的生物活性（图 9）反映了2 L 规模的情况，表明这种补料分批工艺对于扩大规模是稳定的。
作者通过生物工艺优化将 GSCHO 细胞系中的 Fc 融合蛋白生产率提高四倍时，观察到唾液酸含量出现不良下降。研究唾液酸含量降低的潜在机制，发现有限的核苷酸糖前体和细胞外唾液酸酶并不是滴度提高后唾液酸含量降低的原因。寡糖分析表明，蛋白质半乳糖基化的缺乏是唾液酸含量减少的潜在原因。因此，我们通过评估 2 L 生物反应器中的半乳糖补充来验证这一概念。向生物反应器中添加 20 mM 半乳糖导致总唾液酸含量增加 44%，唾液酸化聚糖含量增加 20.3%。当该工艺在 200 L 规模的生物反应器上运行时，这些数据得到了进一步验证。这些数据共同表明，半乳糖基化在当前系统中的唾液酸化中发挥着明显的作用。本篇文献的研究为细胞培养工艺优化以提高唾液酸含量提供了一种思路。
星辰纯视界小程序平台
