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一篇来自Genentech的研究文献，主要内容是研究了在使用 CHO 表达系统放大治疗性抗体生产过程中发现的显著的二硫键还原问题。
作者在使用 CHO 表达系统生产治疗性抗体的过程中遇到了显著的抗体二硫键还原问题。即在特定条件下，在收获操作（离心和过滤）和/或第一个纯化步骤（即蛋白 A 层析）后观察到抗体链间二硫键的大量减少。在一个案例中，据估计，在蛋白A 步骤后，只有 10% 的抗体保持完整。这种抗体还原并不是特定抗体或特定细胞系的独特问题，因为在生产和实验室规模的多种抗体中都观察到了这种现象。
导致抗体还原的确切条件仍然难以确定，因为还原现象并不总是在生产规模上发生。不过初期的研究表明，收获步骤中产生的过量机械细胞裂解是抗体还原的重要因素，并且在蛋白 A 流穿液中也观察到还原活性。
尽管在HCCF中发现了还原活性，并且会保留在蛋白A层析的流穿液中，但还是不清楚该还原活性的物质是小分子或大分子，因此设计了透析实验。在此透析实验中，将完整抗体放入 MWCO 为 7,000 Da 的透析袋中，并在不锈钢迷你罐中的 HCCF 中孵育。
结果显示，孵育期后袋内的抗体没有还原（图1a），而HCCF中袋外的抗体在孵育开始后不久就显著减少。
游离巯基测量（通过使用 mBB 对巯基进行衍生和定量）显示，在孵育开始时透析袋内不存在游离巯基，然而，在孵育开始后<5小时内，透析袋内外的游离巯基水平变得相当，这表明HCCF中含有小分子的游离巯基不受限制地进入透析袋中。
这个结果显示，透析袋外发生的抗体还原不是由含有游离巯基的小分子引起的。由于仅在截留分子量为 7,000 Da 的透析袋外部观察到还原，因此还原分子的分子量必须 >7,000 Da。该透析实验的结果表明，酶促反应是观察到的抗体还原的原因。
对生产过程中的蛋白 A 洗脱收集液进行了 LC-MS 分析。质谱数据分析表明仅链间二硫键被还原，导致蛋白A洗脱收集液中存在轻链和重链。然而，轻链和重链中的链内二硫键仍然完整。
随后使用 LC-MS 检测进行的肽图分析也证实还原仅发生在链间二硫键处。仅链间二硫键被还原的事实与透析实验的结果一致，表明HCCF中抗体的还原是由大分子还原引起的，因为链内二硫键通常位于抗体内部，难以被还原酶接近。
调节细胞内氧化还原环境的酶系统主要包括：Trx系统（硫氧还蛋白）和Grx系统（谷氧还蛋白）。其中Trx系统可以还原蛋白质内的二硫键，不过需要消耗NADPH。
猜测Trx系统可能是本案例中的主要作用系统，因此设计体外实验进行证明。
结果是，基于微芯片的毛细管电泳结果表明Trx系统可以在体外还原抗体。
测试了两种市售的 TrxR 特异性抑制剂 ATG 和 ATM 在体外抑制 Trx系统和抗体还原的能力。结果显示ATG 和 ATM 的确都可以有效抑制上述测定中的抗体还原。
有文献报道硫酸铜可以提供氧化还原电势，以最大限度的减少重组抗体分子的游离巯基，因此测试了硫酸铜是否可以在体外抑制Trx系统以及随后的抗体还原。在此体外还原实验中，缓冲系统从 PBS 改为硫酸组氨酸，以避免形成不溶性 Cu3(PO4)2。
结果显示抗体很容易被组氨酸硫酸盐缓冲液中的 Trx 系统还原（甚至比 PBS 缓冲液中更快），但在此反应中添加 CuSO4 明显抑制了抗体还原。
测试金化合物ATG和ATM对HCCF中抗体还原的影响。
结果显示，对照实验中，发酵罐产生的HCCF中抗体很容易被还原，然而，当 HCCF 中添加 1 mM ATG 或ATM 时，抗体还原事件被完全抑制。这些结果表明 Trx 系统在 HCCF 中活跃并直接导致抗体减少。
Trx系统还原二硫键需要NADPH。当HCCF经历多次冷冻/解冻循环后会失去还原活性，但是额外添加5mM的NADPH后则可以再次观察到抗体还原事件。
这些结果表明，在失去还原活性的HCCF 中，Trx 系统仍然完好无损。随着时间的推移，HCCF中的还原活性消失，因为 NADPH 源被耗尽。支持这一假设的另一个实验涉及将 G6P (10 mM) 添加到相同的非还原性 HCCF 中。结果表明，G6P的添加也能够重新激活Trx系统，并随后减少HCCF孵育实验中的抗体（图8c）。这是一个非常重要的结果，因为它表明 HCCF 中抗体的减少是由 Trx 系统和 G6PD 的活性引起的。
在HCCF孵育实验中还观察到EDTA可以有效抑制抗体的减少。
如图9a所示，HCCF在环境温度下孵育19小时以上后，抗体被还原。然而，当向 HCCF 中添加浓度为 20 mM 的EDTA 时，还原作用被完全抑制（图 9b）。由于EDTA是一种金属离子螯合剂，尤其是Mg2+螯合剂，因此它可以是己糖激酶的有效抑制剂。过量 EDTA 可以有效阻止还原的观察结果表明己糖激酶（即提供 G6P）参与了抗体还原机制。EDTA 显然通过消除己糖激酶活性并随后阻断 Trx 系统激活所需的 G6P 和NADPH 的产生来阻止抗体还原。
基于上述研究发现，任何能够有效阻断三种酶系统（Trx 系统、G6PD 或己糖激酶）之一的方法都可能在生产过程中使用，用来防止抗体还原。此外，调节 HCCF 的氧化还原电位可以提供消除抗体还原的另一种方法。
综合考虑预防还原的有效性，以及对产品质量、下游纯化性能、下游去除和可生产性，可选择采取的措施包括：用化学物质（例如硫酸铜、半胱氨酸）调整细胞培养基，以及在收获前和收获后向 CCF 添加（例如硫酸铜、EDTA、L-胱氨酸）。还可以通过用空气喷射 HCCF 以维持 HCCF 中的氧化还原电位来防止抗体还原，除此之外，还可以通过持续氧化还原形式的 Trx 和 TrxR 来消耗葡萄糖、G6P和 NADPH。最后一种阻止抗体还原的非特异性方法是降低HCCF 的 pH 值。巯基-二硫键交换是一种在较低 pH 值下特别缓慢的反应。
二硫键还原对抗体生产提出了重大挑战。在本篇文献中，作者已经确定了抗体还原的机制。报告中提供的数据强烈表明抗体还原的根本原因是 HCCF 中活跃的 Trx 系统。研究数据还表明，Trx 系统活动所需的 NADPH 由G6PD 和己糖激酶的功能。根据已确定的还原机制，任何可以阻断所涉及的三种酶系统（Trx 系统、G6PD 和己糖激酶）之一的抑制剂、方法或过程都可用于防止重组蛋白生产中的二硫键还原。
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