抗体链间二硫键还原的机制~~

文摘   2024-11-01 10:34   山东  

文献阅读


一篇来自BMS、GSK、Wuxi Biologics以及Ultrgenyx公司的专家联合发表的文献,文献要点包括:

• 通过实验发现了 IgG1 和 IgG4 抗体各自优选的二硫键还原途径,这是由这些二硫键的不同溶剂可及性驱动的。

• 在分子动力学模拟的帮助下,通过计算解释了溶剂的可及性。

• 为开发稳健的生物制剂工艺和设计双特异性抗体和基于半胱氨酸的抗体-药物偶联物提供了见解

工艺中间品的 IgG1 和 IgG4 的不同 LMW 模式

在抗体纯化开发中,在 HCCF、蛋白A 层析洗脱液和离子交换层析洗脱液等工艺中间体中观察到了 LMW 物质。具有不同种类:HHL(一种缺少一条轻链的 mAb)或HL(半抗体)作为主要的 LMW 种类

IgG1 和 IgG4 具有不同 LMW 模式:HHL是 IgG1 mAb 的主要 LMW 种类,而 HL 是 IgG4 mAb 的主要LMW 种类。因此,我们猜测 mAb 通过不同的途径形成LMW。

在左侧,HH 间二硫键首先断裂,在还原剂存在下形成两个半抗体 (HL),然后进一步断裂重-轻链间二硫键。该途径被称为HL途径。在右侧,重轻链间二硫键首先断裂形成HHL,然后进一步还原为HH。最后一步是断裂两条重链之间的二硫键。该途径被称为HHL途径

使用 TCEP 还原单克隆 IgG1 和 IgG4

为了证明这一假设,本研究使用了两种模型分子 mAb1 (IgG1) 和 mAb2 (IgG4)。mAb1 和 mAb2 均经过不同量的还原剂TCEP 处理,然后使用基于微芯片的毛细管电泳进行分析。

结果表明mAb1和mAb2具有不同的LMW模式,这表明mAb1和mAb2遵循不同的LMW形成途径。mAb1 主要遵循 HHL 途径。随着还原剂TCEP浓度从0mM逐渐增加到10mM,HHL随着TCEP浓度从0mM增加到4mM而逐渐增加。HH 作为 6 mM TCEP 的中间体出现。mAb1 在≥8 mM TCEP 时完全还原为 H 和 L。HL 中间体几乎不出现在 mAb1 LMW 形成中。相比之下,mAb2 主要遵循 HL 途径。在 2 mM TCEP 下,mAb2 几乎没有还原。随着 TCEP 增加到 4 mM,mAb2 开始形成 HHL、HL 和 L 作为主要种类。从 6 到 10 mM,HHL 逐渐减少,HL 逐渐增加。正如预期的那样,H 和 L 也在增加。然而,在增加TCEP 的同时,HH 水平仍然很低。以 HL 为特征物种且几乎没有 HH 物种的 mAb2 的 LMW 模式表明 mAb2 主要遵循 HL 途径。

另外,还观察到在最高研究的 TCEP浓度 (10 mM) 下,mAb1 完全还原为 H 和 L,而 mAb2 仅部分还原为 H 和 L(H 和 L 积分之和仅占 28%)。这一系列证据表明,mAb2 比 mAb1 对还原剂TCEP 具有更强的抵抗力。

最后使用其他还原剂,比如2-巯基乙醇 (bME) 和二硫苏糖醇 (DTT),或者其他模型分子,比如另外三个 IgG1 分子 (mAb3, 4, 5) 和另外四个 IgG4 分子 (mAb6, 7, 8, 9),都观察到了类似的还原模式。

综合这些结果证明IgG1 分子主要遵循 HHL 途径,IgG4 mAb 主要遵循 HL 途径形成 LMW。还证实IgG4比IgG1对还原剂TCEP具有更强的耐受性。

使用 TCEP 减少人血浆 IgG1 和 IgG4

为了消除测试的分子的偏差,使用从Sigma-Aldrich 购买的人骨髓瘤血浆纯化的 IgG1 和 IgG4 进一步测试了这一假设。商业化的血浆IgG主要特点为,多克隆抗体,并且IgG4铰链区不含有人为的工程化

结果显示,人骨髓瘤血浆 IgG1 的 LMW 形成模式与图 3 中单克隆IgG1 mAb1 的 LMW 形成模式相匹配。人骨髓瘤血浆IgG4在还原过程中几乎没有出现 HHL 和 HH 物种。这表明人骨髓瘤血浆 IgG4 几乎完全遵循 HL 途径。在人骨髓瘤血浆 IgG4 和工程化 IgG4 上观察到的不同现象,归因于其铰链区的工程化的差异(CPSC 与 CPPC 基序)。

链间(HL间和HH间)二硫键的溶剂可及性

IgG1 和 IgG4 链间二硫键的结构分析揭示了一些关键差异。 HL间二硫键形成于轻链最后一个半胱氨酸残基与IgG1中CH1结构域末端的半胱氨酸残基或IgG4中VH和CH1结构域之间的半胱氨酸残基之间

MD 模拟轨迹中 IgG1 中 HL 间二硫键的溶剂可评估表面积显著高于 IgG4 中的溶剂可评估表面积

HH 间二硫键位于 IgG1 和 IgG4 铰链区的CPPC 基序中。IgG1 的铰链区有 17 个残基 (DKTHTCPPCPAPELLGG),其中有 4 个脯氨酸 (P) 残基,而 IgG4 的铰链区有14 个残基 (PPCPPCPAPEFLGG),其中有 6 个脯氨酸 (P) 残基。脯氨酸是唯一一个侧链与其主链原子共价键合的残基,这导致了其刚性。可以引入脯氨酸来使柔性区域刚性化,以增强蛋白质的热稳定性。与 IgG4 的铰链区相比,IgG1 的铰链区更长,脯氨酸残基更少。预计 IgG1 铰链区更加灵活,这可能会导致更高的溶剂可及性。

对设计双特异性抗体和抗体-药物偶联物的意义

据报道,IgG4 的独特特性(例如易于形成半分子)归因于 HH 链间二硫键对还原剂的敏感性。工程双特异性抗体是一种新兴的治疗方式,由于两种不同的靶向 Fab 的提供,扩展了 mAb 的功能。尽管 IgG4 中的 Fab 臂交换被认为是设计 mAb 时的不良特性,但在设计与 CH3 结构域中的旋钮孔 (KIH) 策略相结合的双特异性抗体时,它可能是一个有益的特征。我们的研究表明,IgG4具有在不破坏 HL 间二硫键的情况下形成半分子的优势,可以与另一个半分子交换形成双特异性抗体。

基于半胱氨酸的 ADC 利用 mAb 中的半胱氨酸来结合细胞毒性剂。完整的 IgG1 或 IgG4 包含 16 个半胱氨酸对,包括 12 个链内二硫键和 4 个链间二硫键。由于溶剂可及性较高,形成半胱氨酸残基的四个链间二硫键是偶联的主要目标。通过利用抗体中不同二硫键对还原剂的不同敏感性,可以选择性还原某些链间二硫键以开发相对位点特异性的 ADC。图3和4表明IgG1需要较少量的还原剂来破坏链间二硫键并且HL间二硫键首先被还原。这意味着通过控制还原剂的量,可以打开两个HL间二硫键并与细胞毒性剂缀合,而不破坏HH间二硫键。IgG1 中 HL 间二硫键的高溶剂可及性(图 6)意味着与 IgG1 中 HL 间二硫键缀合的细胞毒性剂可能有助于提高 ADC 反应速率。

证明了 IgG1 比 IgG4 对还原剂 TCEP 更敏感。IgG1 倾向于遵循 HHL 途径形成 LMW,而 IgG4 倾向于遵循 HL 途径。链间二硫键的溶剂可及性解释了实验观察结果,并说明了 IgG1 和 IgG4 的 LMW 形成的机制见解。从铰链区链间二硫键的敏感性和可及性的角度来看,我们的结果表明IgG1在设计基于半胱氨酸的ADC时可能具有优势,而IgG4在设计双特异性抗体时可能具有优势。

总结

在本篇文献的研究中,证明了 IgG1和 IgG4 对还原剂 TCEP 的敏感性不同,并且它们遵循不同的途径形成 LMW。我们的研究表明,IgG1 比IgG4 对 TCEP 更敏感治疗性 IgG1 和人血浆 IgG1 均遵循重重轻链 (HHL) 途径,以 HHL 和 HH 作为中间物种。铰链区带有 CPSC 基序的人血浆 IgG4 遵循重轻链 (HL) 途径,以 HL 为中间物种。然而,治疗性 IgG4 遵循混合途径,以 HL 途径为主要途径,以 HHL 途径为次要途径。使用从计算模型和分子动力学模拟获得的链间二硫键的溶剂可及性进一步解释了这些实验观察结果。这项研究的结果提供了 IgG1 和 IgG4 的 LMW 形成的机制见解,可以基于此为双特异性抗体和基于半胱氨酸的抗体-药物偶联物选择 IgG1 或 IgG4。

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