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蛋白A亲和层析捕获后一般会链接一个低pH的病毒灭活步骤，因此可以方便的集成一个辛酸（CA）诱导杂质沉淀的步骤。本篇文献首先研究了CA浓度和pH值对mAb 产量，HCP去除以及 mAb 单体含量的影响。
蛋白A层析后 CA 诱导的杂质沉淀
通过在 pH 4.6-6.3 下添加 20-80 mmol L−1 CA 诱导蛋白A 洗脱液中的杂质沉淀。在 pH 4.6 时，所有三种测试的 CA 浓度导致 HCP 清除率相当，从 3161 ppm（起始 HCP 含量）到 29–38 ppm，而 mAb 则高产率 (96–97%) 。此外，pH 4.6 时的 mAb 单体含量从 97.0% 略有增加至约 97.5%。
在 pH 5.5 和 20 mmol L−1 CA 条件下，残留 HCP 的水平 (701 ppm) 明显高于 pH 4.6 (38 ppm)。同时，单体水平未受影响（97.0%）。通过将 CA 浓度增加至 40 和 80 mmol L−1，同时保持 pH 值恒定在 5.5，HCP 含量降低至 13-42 ppm，mAb 单体水平增加至 97.4-97.8%。除了最高 CA 浓度为 80 mmol L−1 (91%) 外，在 pH 5.5 时实现了 96% 和 97% 的高 mAb 产率。
pH 6.3 对 HCP 沉淀无效，即使在最高浓度 80 mmol L−1 CA 下也是如此。虽然溶液中的 mAb 产率始终很高 (> 90%)，但 mAb 单体含量下降了 0.5%。
总结来讲，CA 在 4.6-5.5 pH 范围内显著提高了杂质沉淀，最高可达 2 LRV。因此，通过在蛋白A 层析后实施 CA 诱导沉淀，可以实现低于 100 ppm 的 HCP 值。
CA 诱导纯 mAb 样品沉淀
由于不同 IgG 在 CA 诱导沉淀中的稳定性尚未发表，为了研究其对平台工艺的适用性，作者系统地评估了 13 种不同 IgG。
pH 5.0 时 CA 浓度为 10 至 120 mmol L−1 时的 MAb 产量，在 10 mmol L−1 的最低 CA 浓度下，整个 mAb 仍保留在溶液中，产量高达 86 至 98%。当 CA 浓度为 20 和 40 mmol L−1 时，产率显著下降，并且在浓度达到 120 mmol L−1 时保持恒定。
对于四种单克隆抗体，≥20 mmol L−1 CA 的 CA 处理导致聚集体含量下降。 CA 对 5 种 mAb 没有显著影响，但起始材料中的聚集体含量已经很低。仅在 10-40 mmol L−1 CA 的中等 CA 浓度下，两种 mAb（F、K）显示聚集水平略有增加，而 mAb L 和 M 在添加 CA 后易于聚集。
mAb在CA沉淀中的收率的影响因素，作者研究了mAb的等电点、疏水性和Tm值，都发现没有特别的相关性。最后的研究发现，mAb LC pI 与 CA 诱导沉淀中 mAb 稳定性的相关性。 LC 的 pI 越酸性，pH 5.0 时 CA 诱导沉淀的产率越低。
为了验证这一假设，在较高 pH 值下进行了 CA 诱导沉淀的实验。结果显示，pI 值约为 6 的 mAb G 和 mAb E LC 在相应浓度 5.5 mmol L−1 的CA 下完全沉淀，导致产率极低，< 4%。同样，LC pI 值为 5.4 的 mAb K 容易发生 CA 诱导沉淀，导致产率低至 63%。相比之下， mAb A、C 和 D 代表具有基本 LC pI 值 (pI > 7.8)的分子产率约为 80%以上。
CA 诱导蛋白质沉淀的拟议机制
通常认为，质子化 CA 辛基部分的主导疏水性允许分子穿透蛋白质水合壳并增强界面表面的疏水性。结果，蛋白质之间的吸引力增加，最终导致部分解折叠和蛋白质沉淀。
基于本文的发现，作者认为CA与单抗互补决定区相邻的大的疏水区域相互作用可能是CA沉淀的主要作用机制。另外，Chen 等人 (2016) 发表的结果比较了全 IgG 与游离 LC 的稳定性，清楚地表明弱酸性 LC 比全 IgG 更容易发生 CA 诱导的沉淀，也支持了这一观点。
CA的病毒灭活能力
CA 诱导病毒灭活的效率在两项病毒清除研究中进行了评估。
15分钟的孵育时间后迅速实现完全灭活。终点滴定 (EPT) 显示在 pH 5.1 的两种 CA 浓度（6.2 和 15 mmol L−1 ）下均没有残留感染性。大体积平板接种 (LVP) 显示 60 分钟孵育时间后 log10 减少值 (LRV) ≥5.5 LRV。在对照测定中，将包膜病毒暴露于仅 pH 5.1 且不含 CA 的环境中，导致LRV < 1。因此，CA 在极短的孵育时间后可高效灭活包膜病毒，是传统低 pH 值的绝佳替代方案以及溶剂/洗涤剂处理。
在 pH 5.6 和 pH 6.5 下测试了 3 mmol L−1 和 6 mmol L−1 的 CA 浓度，较高的 pH 值导致 CA 质子化失活形式的浓度较低 (0.1–1 mmol L−1 )。结果，即使在延长 300 分钟的孵育时间后，所有四种测试条件下的 A-MuLV 清除率仍确定为 < 1 LRV。因此，CA 的病毒灭活能力可以很容易地通过 pH 值来控制，pH 值定义了质子化 CA 的浓度。
根据结果，1 mmol L−1 的质子化 CA 浓度可被视为 A-MuLV 失活开始显著的临界浓度，而 2.4 mmol L−1 已导致 ≥5.5 LRV 完全失活。
总结
本研究研究了多种工艺相关因素，例如 pH 范围、辛酸浓度和抗体稳定性，以实现强化纯化工艺，包括用于 HCP 去除的辛酸沉淀，在 mAb 产量 > 90% 的情况下，降低值高达 2 log10。另外13 种不同单克隆抗体的比较显示，在辛酸诱导的杂质沉淀过程中，抗体回收率在 65-95% 之间存在显著差异。在六种比较的物理化学特性中，发现轻链具有弱酸性 pI 的抗体对辛酸诱导的沉淀非常敏感，导致产量较低。病毒清除研究表明，辛酸可以完全灭活包膜病毒。这三项研究的综合结果应该使我们能够设计一个步骤更少、效率更高的强化抗体制造工艺，同时保持工艺稳健性。
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