编辑推荐︱基于树状大分子荧光成像试剂的制备及其癌症生物医学应用
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2024-10-25 08:30
北京
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作为一种高灵敏度、高空间分辨率的分子影像学技术，荧光成像在癌症诊断和治疗领域应用广泛。然而，常见的荧光成像试剂，如小分子荧光染料、无机荧光纳米颗粒等存在光稳定性差、体内代谢速度快、病灶部位富集度低等缺陷，限制了其在癌症荧光成像领域的应用。近年来，树状大分子的出现为纳米荧光成像试剂的开发提供了新策略。树状大分子由中心核、内部重复单元及丰富的末端官能团三部分组成，其优异的结构可使其负载小分子荧光染料或无机荧光纳米颗粒以实现癌症早期荧光监测并评估其体内分布及代谢。此外，部分氨基封端的树状大分子还可通过自发荧光监测癌细胞对其摄取行为。树状大分子的引入极大提高了荧光染料及无机荧光纳米颗粒的水溶性及生物相容性，且树状大分子的表面功能化修饰可实现其组织特异性递送，最重要的是树状大分子的保护可极大程度避免荧光淬灭，实现长时间荧光成像。因此，本文重点阐述了各类基于树状大分子的荧光成像试剂，总结其合成方法及其癌症荧光成像应用，并对其未来发展方向进行展望。
【关键词】分子影像学 ; 树状大分子 ; 荧光成像 ; 纳米载体 ; 生物医学应用
【作者信息】第一作者：岳林杰；通讯作者： 朱静怡
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癌症作为威胁人类健康的重要疾病之一。截至2022年，中国和美国分别有约4 820 000例和2 370 000例新发癌症病例，以及3 210 000例和640 000例癌症病患死亡。癌症生长无序、增殖无限、易转移等特点，是导致癌症晚期患者死亡概率高的主要原因。因此，早期癌症的灵敏准确诊断对进行及时、有效的癌症治疗至关重要。这不仅可以提高癌症病患生存率，还可减轻病患长期治疗的痛苦。近年来，生物医学领域中的癌症生物标志物的识别和癌症治疗过程的实时监测发展迅速。而活体成像技术在分子生物标志物成像和活体肿瘤组织可视化方面发挥着重要作用，为肿瘤早期诊断和预后提供了有效途径。与传统的影像学手段，如X射线断层扫描（CT）、磁共振成像（MR）、正电子发射计算机断层成像（PET）和单光子发射计算机断层扫描（SPECT）等相比，荧光（FL）成像具有非侵入性、无辐射性、高性价比、高分辨率及操作简易等优势，在指导肿瘤精准切除、高效区分正常组织及病变组织方面具有较高的生物医用价值。究其原因，FL成像依靠特定荧光标记物进行体内示踪，可对活体组织生理及病理过程中分子和细胞活动进行定性、定量研究，在分子水平上可实现实时可视化。荧光探针的选择是实现高效FL成像的关键。常见的荧光探针可分为小分子荧光染料（酞菁类（Pc）、花菁类（Cy）、异硫氰酸荧光素（FITC）等）、荧光量子点（硒化镉（CdSe）、硫化锌（ZnS）、砷化铟（InAs）等）和天然荧光蛋白（红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等）等。但这些小分子探针大都存在相同的缺陷。首先，小分子荧光探针普遍存在水溶性差、稳定性低和特异性差的问题；其次，单个小分子荧光探针只有少量荧光团，导致检测灵敏度相对较低；再次，小分子荧光探针易无法控制的从细胞中泄露，并很快失去荧光活性。基于上述问题，基于小分子荧光探针的FL成像试剂已不能满足当前FL成像的需求。随着纳米科学的发展，医用纳米材料的开发为FL成像试剂的发展提供了新方向。纳米材料因具有较大比表面积，可同时负载多个荧光探针分子，在防止荧光猝灭的同时能提供更强的荧光信号。此外，可在负载荧光探针的纳米颗粒表面修饰靶向配体，利用靶向策略以提高病变部位荧光探针浓度，从而实现低浓度荧光探针介导的高效FL成像。环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）-聚乙二醇（PEG）和Cy5.5与第5代（G5）聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子共价连接得到的靶向荧光纳米探针（RGD-PEG-PAMAM-Cy5.5）处理荷瘤鼠后，肿瘤与背景荧光信号比（TBR）随着时间的延长而升高，并在24 h荧光信号强度达到峰值（TBR = 5.09 ± 1.22）。而将RGD与Cy5.5共价键合得到的靶向小分子荧光探针（RGD-Cy5.5）处理荷瘤鼠后，仅5 h肿瘤处荧光信号强度就达到峰值（TBR = 3.1±0.9），之后随着时间的延长RGD-Cy5.5处理的荷瘤鼠肿瘤处TBR值逐渐降低，表明RGD-Cy5.5逐渐代谢出体外。值得注意的是，RGD-PEG-PAMAM- Cy5.5在肿瘤处的最大TBR值远高于RGD-Cy5.5在肿瘤处的最大TBR值，这表明与靶向试剂RGD修饰的小分子荧光探针RGD-Cy5.5相比，靶向试剂RGD修饰的纳米荧光探针RGD-PEG-PAMAM- Cy5.5在肿瘤处有更高的积累量，从而介导高效FL成像。因此，为实现高效FL成像开发基于纳米材料的FL成像试剂尤为关键。纳米材料常以纳米载体为依托，在众多常见的纳米载体中，树状大分子因其独特的结构及优异的理化性质，常用于构建多种纳米成像试剂。作为一种纳米级超支化球状大分子，树状大分子具有明确精准的化学结构，其由一个中心内核（单个原子或一组原子）、与核相连的重复结构单元和末端官能团组成（图1）。基于树状大分子内部及表面众多水溶性原子构成的超支化结构，其可与疏水性小分子荧光探针结合赋予小分子荧光探针良好的水溶性及稳定性，并提高其荧光量子产率，延长光漂白时间。例如，Yang等以不溶于水的小分子荧光染料苝二酰亚胺（PDI）为核心，将聚甘油树状大分子（PGD）修饰在PDI的海湾（β）位，得到外围具有8个PGD可在水中完全溶解的“核-壳”状PGD-PDIs，8个PGD上128个水溶性羟基末端基团使疏水的PDI表现出良好的水溶性、光稳定性和极高的荧光量子产率。与游离的小分子荧光染料PDI荧光量子产率（0.58）相比，PGD-PDIs具有明显高的荧光量子产率（0.83），且经多种金属离子荧光猝灭剂处理后PGD-PDIs的荧光响应比率仍高达95%。由此表明，基于PGD的存在赋予了PGD-PDIs水溶性、光稳定性，且PDI的荧光量子产率得到极大提升。此外，借助树状大分子末端官能团修饰小分子荧光染料可延长小分子荧光染料光漂白时间。例如，Kim 等[29]发现，在第6代（G6）PAMAM树状大分子表面共价键合14个Cy5的功能化树状大分子（Cy5-FDN）比游离Cy5的光漂白寿命提高了17倍。且通过单分子成像技术确定荧光探针的定位精度，发现Cy5-FDN的定位精度（5.1 nm）约为小分子荧光探针Cy5定位精度（9.8 nm）的2倍。PAMAM树状大分子的存在增强了Cy5的光稳定性及定位精度。基于树状大分子诸多优良性质，其常被选作优异载体用于构建FL成像试剂。![]()
图1 树状大分子结构图
目前，众多基于树状大分子的FL成像试剂已被开发并进行了生物医学应用，可实现肿瘤早期的高效诊断、监测。如今已知的基于树状大分子的FL成像试剂可分为：树状大分子自发荧光、荧光染料分子载入的树状大分子和树状大分子负载无机荧光纳米颗粒，其具有不同的FL成像特性。因此，本文将围绕具有荧光性能的功能化树状大分子的前沿进展，对其制备方法及对肿瘤的生物医学应用进行归纳阐述，以期为新型多功能荧光造影剂的开发及临床前应用提供思路。树状大分子是最早被广泛研究的树状聚合物之一。其中，PAMAM树状大分子和聚赖氨酸树状大分子虽不具有传统意义上的荧光发射基团，但仍能产生自发荧光效应，且通过改变条件可调控荧光强度，可直接用于生物成像。基于树状大分子固有的荧光特性，可构建多种功能化递送载体、纳米探针及生物标记物用于生物成像。Tsai等以具有固有自发荧光性质的氨基封端的PAMAM树状大分子为平台，通过静电作用与三种反义寡核苷酸（AS-ODN）序列p75、NGF1和NGF2结合，以制备不同氮磷比（N/P）的荧光PAMAM树状大分子（F-PAMAM），从而抑制大鼠胶质瘤C6细胞中的p75神经营养因子受体（p75NTR）或神经生长因子（NGF）。基于F-PAMAM自身固有的荧光属性，故无需额外荧光标记，即可通过荧光显微镜和流式细胞术分析该F-PAMAM/ AS-ODN络合物的细胞摄取行为。由流式细胞术测试F-PAMAM/AS-ODN络合物荧光强度可知，C6细胞对F-PAMAM/AS-ODN（p75）络合物具有相对较高的摄取效率，且分析各F-PAMAM/AS- ODN络合物在不同N/P比下的平均荧光强度可知，即使在N/P比为40时，C6细胞对反义寡核苷酸序列NGF2的摄取效率也相对较低。虽然在荧光显微镜下，经F-PAMAM/AS-ODN（p75）络合物转染的C6细胞荧光强度和清晰度与传统染料标记体系无法比拟，但荧光强度的轻微增强表明随着N/P比从10增加到20，细胞摄取效率有所增加。且在N/P = 20时，由原子力显微镜分析证实，p75与PAMAM树状大分子形成了尺寸小于200 nm的凝聚态良好的球形粒子（图2）。基于F-PAMAM固有的荧光属性，其作为双功能化基因载体和荧光探针，不仅可确定递送不同反义寡核苷酸的最佳N/P比，还可分析C6细胞对F-PAMAM/AS-ODN（p75、NGF1及NGF2）络合物的细胞摄取效率。这种基于荧光树状大分子的反义寡核苷酸递送体系便于研究者直观分析评估细胞对其的摄取行为，有望作为基因载体同时实现递送、转染及生物成像。图2 自发荧光PAMAM树状大分子作为核酸载体和纳米探针的生物成像和转染过程
Wang等以G5 PAMAM树状大分子为平台，通过封端氨基乙醛化制备了无需荧光标记即具有荧光性质的树状大分子（F-G5），由形成的席夫碱C=N键经n-π*跃迁产生较强绿色荧光信号。进一步PEG化形成F-G5-PEG，基于其较强的绿色荧光，可发现F-G5-PEG在人类黑色素瘤SKMEL28细胞中具有细胞实时追踪能力，随着孵育时间延长至24 h，细胞内绿色荧光信号明显增强，且F-G5-PEG内吞后主要在溶酶体中聚集。且在孵化24 h后，可发现细胞边缘出现F-G5-PEG的亮绿色颗粒，这是由F-G5-PEG受到SKMEL28细胞的胞吐作用所致。以F-G5-PEG为纳米平台，采用溶剂置换法将抗癌药物阿霉素（DOX）包封其中构建了F-G5-PEG/DOX，经其独特的树状大分子自发荧光性质可监测SKMEL28细胞对其的细胞摄取，与G5 PAMAM树状大分子相比，F-G5-PEG提高了DOX的递送效率，且在微酸性环境下加速了细胞内DOX的释放。该种新型F-G5-PEG纳米平台为荧光追踪并受控递送抗癌药物奠定了基础。基于树状大分子自发荧光，使构建的多种功能化树状大分子无需额外载入荧光试剂即可在细胞层面监测摄取行为，可实现药物、基因的有效递送，并经自身固有荧光特性评估细胞摄取效率，便于进行即时生物FL成像。但自发荧光的功能化树状大分子荧光效应易受树状大分子代数、浓度及封端基团所处环境pH影响，这些因素易造成荧光强度的改变，使自发荧光功能化树状大分子介导的FL成像应用受限。因此，如何优化树状大分子结构以降低诸多因素对其自发荧光性质的影响，并优化FL成像效率仍是后续亟待研究之处。荧光染料分子载入的树状大分子作为最常见且应用最广泛的功能化荧光试剂，其典型特征为荧光基团的介入导致功能化树状大分子荧光性能的出现。其常分为荧光染料端基修饰、荧光染料被物理包裹及荧光基团嵌入树状大分子内核三种形式。根据荧光染料分子的不同，常修饰于树状大分子表面的荧光染料包括：FITC类、Cy类、吲哚菁绿（ICG）类等。常包裹于树状大分子内部的荧光染料包括Pc类等。常嵌入树状大分子内核的荧光染料包括PDI、FITC等。荧光染料分子载入的树状大分子不仅提高了小分子荧光染料的水溶性、稳定性，且以树状大分子为媒介经功能化修饰赋予了荧光染料分子载入的树状大分子特异性，可实现癌细胞或肿瘤处特异性FL成像。FITC荧光染料作为一种典型的有机荧光分子，其以芳香环为发色团，并常以异硫氰酸酯基与多种化合物相连。将FITC与树状大分子共价键合不仅可改善FITC水溶性，且在一定程度上可减缓其荧光猝灭速度。Michlewska等以碳硅烷树状大分子（G1-[NH2]4）为平台，将2-吡啶甲醛修饰在其表面，随后以2-吡啶甲醛为桥梁将二氯（甲基异丙苯）钌(Ⅱ)螯合在G1-[NH2]4上，将荧光染料分子FITC共价键合在树状大分子表面得到以钌封端的杂化碳硅烷树状大分子CRD13-FITC。这种新型的金属基树状大分子因过渡金属元素钌的存在具有良好的癌细胞治疗作用。FITC对该功能化树状大分子的修饰并不影响细胞对CRD13-FITC的摄取，且FITC的存在赋予CRD13-FITC癌细胞和正常细胞追踪能力。经流式细胞术及共聚焦扫描显微镜测试可知，经24 h孵化，人白血病肿瘤HL-60细胞对CRD13-FITC的摄取高于正常细胞PBMC细胞对其摄取。且CRD13-FITC在浓度达到10 µmol/L时，对HL-60细胞的细胞毒性高于对PBMC细胞的细胞毒性。这种FITC修饰的钌基树状大分子兼具FL成像及抗癌作用，可用于实时监测癌细胞，为后续对癌细胞治疗效果的深入研究提供基础。同样，Nagai等也以FITC作为FL成像试剂，将FITC修饰的基质金属蛋白酶-2（MMP-2）底物肽（MMP-pep）共价键合在羧基化的树状大分子（COOH-den）表面，随后进一步将肿瘤归巢肽（tLyP-1）经酰胺化反应与MMP-pep/COOH-den结合制备得到MMP-2响应型荧光探针tLyP-1/MMP-pep/COOH-den用于淋巴结转移癌细胞成像。以FITC作为FL成像指导，经荧光显微镜观察tLyP-1/MMP-pep/COOH-den被不同细胞摄取情况，可知在MMP-2高表达的人纤维肉瘤HT-1080细胞和小鼠乳腺癌4T1细胞中，tLyP-1/MMP-pep/COOH-den被摄取含量较高，因而在这两种细胞中表现出明显的荧光信号；而在MMP-2低表达的小鼠巨噬细胞RAW264中并未观察到荧光信号。同时发现，经基质金属蛋白酶抑制剂（GM-6001）处理的HT-1080细胞和4T1细胞，经tLyP-1/MMP-pep/COOH-den孵育后并未表现出绿色荧光信号，表明荧光信号的MMP-2依赖性。在相同条件下，tLyP-1/MMP-pep/COOH-den在HT-1080和4T1细胞中的平均荧光强度高于无tLyP-1修饰的MMP-pep/COOH-den处理的HT-1080细胞和4T1细胞的平均荧光强度，由FITC介导的FL成像可验证tLyP-1的靶向作用提高了HT-1080细胞和4T1细胞对tLyP-1/MMP-pep/COOH-den的摄取。根据MMP活性，可借助FITC修饰的tLyP-1/MMP-pep/COOH-den观察监测MMP-2分泌的淋巴结转移癌细胞，且tLyP-1可进一步增强癌细胞摄取。这种双肽功能化的树状大分子作为基质金属蛋白酶响应性荧光探针，经FITC介导的FL成像可有效检测淋巴结转移癌细胞。Cy类荧光染料作为常见的生物标记物，基于其对称的吲哚碱发色团，使其具有荧光量子产率高、消光系数高、标记显影时背景弱等特点，因此Cy类荧光染料常用于进行小鼠活体成像。然而，多川结构的Cy染料易发生聚集，且其在体内进行荧光示踪时不具特异性，因此将其与功能化树状大分子结合构建FL成像试剂能极大改善Cy染料的缺陷，提高活体FL成像效果。Chen等首先用热分解法制备掺杂锌的氧化铁纳米八面体（ZIONOs），随后通过与2，3-二巯基丁二酸（DMSA）配体交换，与G5 PAMAM-NH2树状大分子共价键合，并进行甲氧基化聚乙二醇（mPEG）及荧光染料Cy5.5修饰，最后以G5 PAMAM-NH2树状大分子为中介在其表面修饰核蛋白靶向适配体AS1411以制备ZIPP(Cy5.5)-Apt纳米载体。通过将抗癌药物DOX及小鼠单克隆抗体/兔单克隆抗体小干扰RNA（HSP70/HSP90 siRNAs）以G5 PAMAM-NH2树状大分子为媒介包裹进ZIPP-Apt纳米载体中制备得到靶向乳腺癌纳米诊疗络合物ZIPP-Apt: DOX/ siHSPs（图3a）。基于AS1411-核蛋白的亲和力，ZIPP-Apt:DOX/siHSPs的癌细胞摄取和肿瘤特异性积累显著增加，并进一步证实了HSP70和HSP90的同时消耗可诱导癌细胞凋亡，进而实现肿瘤敏磁热疗和化学治疗。ZIPP(Cy5.5)-Apt作为靶向4T1荷瘤鼠双模态近红外（NIR）区FL成像及MR成像试剂，可用于监测纳米颗粒在体内的组织分布并验证其乳腺癌靶向作用。体内FL成像测试结果表明，不论是靶向适配体AS1411修饰得到的ZIPP (Cy5.5)-Apt，还是对照组富C寡核苷酸（CRO）修饰得到的ZIPP(Cy5.5)-CRO，经尾静脉注射至荷瘤鼠体内8 h后，均优先积累至肿瘤处，因而肿瘤处具有较强的红色荧光信号，这可能由于高渗透长滞留（EPR）效应，使得相近大小的纳米络合物被肿瘤非选择性摄取。然而在24及48 h时，ZIPP (Cy5.5)-Apt处理的荷瘤鼠肿瘤处具有明显的红色荧光信号，而在相同时间点下，ZIPP(Cy5.5)-CRO处理的荷瘤鼠肿瘤荧光信号明显减弱，说明ZIPP(Cy5.5)-Apt在48 h时仍然留存在肿瘤处，而ZIPP(Cy5.5)-CRO被快速清除出体内（图3b）。注射材料后48 h，离体肿瘤和器官的NIR区FL成像图证实了ZIPP(Cy5.5)-Apt的肿瘤靶向积累效应，ZIPP(Cy5.5)-Apt处理的荷瘤鼠离体肿瘤荧光信号明显强于非靶向对照组ZIPP(Cy5.5)-CRO处理的荷瘤鼠离体肿瘤荧光信号（图3c）。这种Cy5.5修饰的功能化树状大分子纳米复合体系，经Cy5.5介导可实现靶向乳腺癌NIR区FL/MR成像指导的敏磁热疗和化学治疗，并由Cy5.5介导的荧光成像实现该纳米体系荷瘤鼠体内示踪。![]()
图3 （a）ZIPP-Apt:DOX/siHSPs的合成示意图；（b）荷瘤鼠经尾静脉注射ZIPP(Cy5.5)-Apt或ZIPP(Cy5.5)-CRO后不同时间点下的荧光成像图及（c）注射后48 h的离体器官及肿瘤的荧光成像图除了将荧光染料分子端基修饰于树状大分子表面，还可将荧光染料物理包裹于功能化树状大分子内部介导肿瘤FL成像，如Pc类染料。Pc类荧光染料基于优异的NIR光学性质，既可用于FL成像指导的药物递送，又可经光动力（PDT）疗法对肿瘤进行深层次无创治疗。然而，Pc由于较差的水溶性，在水介质中易通过π-π堆叠和疏水作用聚集，从而导致其激发态的自猝灭，且其对癌细胞不具特异性，导致其临床应用受限。为解决该问题，Taratula等[34]将单取代酞菁（PcSi(OH)(mob)）封装到第4代聚丙烯亚胺（PPI）树状大分子中，随后用PEG和促黄体素释放激素肽（LHRH）对PPI树状大分子表面进行修饰，以提高其生物相容性和癌细胞选择性，由此开发出一种Pc基载入的功能化树状大分子纳米诊疗试剂Pc-LHRH，用于靶向递送Pc至LHRH受体阳性肿瘤处。合成的Pc-LHRH中药物包封率达20% w/w，表现出高效PDT治疗和FL成像所必需的NIR吸收（700 nm）和荧光发射（710和815 nm）。且基于封装的Pc固有荧光特性，可用于Pc-LHRH的体外亚细胞定位和体内器官分布。如图4所示，经体内FL成像可知，在尾静脉注射Pc-LHRH至荷瘤鼠10 h后，肿瘤及肝脏部位具有明显的FL成像信号，表明Pc主要在肿瘤及肝脏中富集，显示其靶向卵巢癌异种移植瘤效果。在无光照辐射下，Pc-LHRH在研究的Pc浓度范围（1.7~7.0 μg/mL）内对人卵巢癌A2780/AD细胞几乎无毒；然而经光辐照下，Pc-LHRH处理的A2780/AD细胞由于产生过量活性氧，导致明显的PDT治疗效果（IC50 = 0.9 μg/mL）。这种Pc载入的功能化树状大分子不仅有效改善了Pc荧光染料的诸多缺陷，且实现了细胞乃至动物层面的FL成像以追踪其在亚细胞及荷瘤鼠体内的分布。这种双功能化肿瘤诊疗试剂实现了NIR区FL成像介导的药物递送及光动力治疗。![]()
图4 基于酞菁负载的树状大分子（Pc-LHRH）的肿瘤靶向诊疗平台示意图
随后，Taratula等又将萘酞菁硅（SiNc）包裹到第5代（G5）PPI树状大分子（PPI G5）中，随后用生物相容性聚合物PEG修饰在其表面，构建的该功能化树状大分子纳米体系将SiNc转化为生物相容性纳米平台SiNc-NP。基于PPI树状大分子疏水性空腔有效包裹并分离单个SiNc分子，减少了SiNc的聚集，提升了SiNc-NP的水溶性，提高了其卵巢癌NIR区FL成像、PDT治疗及光热（PTT）治疗效率。虽然荧光染料端基修饰在树状大分子外围是最常见的构建FL成像试剂的方式，但这通常会减少树状大分子外围修饰位点并影响功能化树状大分子与细胞的相互作用。研究人员发现，PDI、FITC等部分荧光基团可嵌入树状大分子内核，从而发挥荧光特性。这种方法可有效避免荧光染料分子占用树状大分子端基位点。Cong等采用具有荧光特性的四胺修饰的PDI（PDI-NH2）作为成核化合物，与N-叔丁氧羰基（N-Boc）保护和五氟苯酚活化的赖氨酸酯（Boc-Lys(Boc)-OPFP）反应，随后用三氟乙酸去保护，并重复该过程以制备具有荧光特性的PDI为核心的第5代聚赖氨酸树状大分子（PDI-PLL-G5）。最后，用不同数量的具有靶向功能的N-羟基琥珀酰亚胺酯-酰胺己酸-生物素（NHS-LC-B）或NHS-聚乙二醇-生物素（NHS- PEG-B）与PDI-PLL-G5通过酰胺化反应相连，并将PDI-PLL-G5表面剩余氨基乙酰化，得到生物素化的PDI-PLL-G5（G5-LC-5B、G5-PEG-1B、G5-PEG- 3B和 G5-PEG-5B）。此外，研究人员还将未经生物素修饰的PDI-PLL-G5表面氨基乙酰化，得到乙酰化的PDI-PLL-G5（G5-Ac）。基于PDI核心的荧光特性，可监测生物素偶联的PDI-PLL-G5被小鼠乳腺癌4T1细胞摄取的能力。G5-PEG-1B孵育的4T1细胞显示的荧光信号强于非靶向G5-Ac孵育的4T1细胞显示的荧光信号，且G5-PEG-5B孵育的4T1细胞中的荧光亮度明显高于G5-PEG-1B和G5-PEG-3B，表明相同条件下G5-PEG-5B被4T1细胞摄取最多。相比之下，G5-LC-5B处理的4T1细胞的荧光信号较弱，表明LC-B的引入不能促进4T1细胞对PDI-PLL-G5的摄取。基于PDI的荧光特性，后续评估了生物素化的PDI-PLL-G5对4T1荷瘤鼠的体内靶向肿瘤FL成像效果。研究发现，G5-PEG-5B、G5-PEG-3B、G5-PEG-1B、G5-LC-5B和G5-Ac尾静脉注射至4T1荷瘤鼠1 h后，所有组的4T1荷瘤鼠中均呈现强烈的荧光信号。随着时间的推移，G5-Ac、G5-LC-5B和G5-PEG-1B处理的荷瘤鼠体内荧光信号逐渐减弱。相比之下，G5-PEG-3B和G5-PEG-5B处理的荷瘤鼠体内荧光信号在体内停留的时间更长，肿瘤中的荧光信号随时间推移逐渐增加（图5a）。经由体内FL成像实验证实，提高PDI-PLL-G5中PEG-B的修饰量可增加PDI-PLL-G5在肿瘤部位的积累，从而介导高强度荧光信号。通过定量分析肿瘤区域荧光强度，进一步量化生物素化PDI-PLL-G5在4T1肿瘤中的积累量。G5-Ac、G5-LC-5B和G5-PEG-1B组肿瘤的荧光强度随时间的延长不断降低，但G5-PEG-3B和G5-PEG-5B组的肿瘤荧光信号在开始注射时随着时间延长而增加。其中，G5-PEG-3B组肿瘤的荧光信号在8 h后随时间延长迅速减弱。而G5-PEG-5B组肿瘤的荧光强度在24 h内持续增加，且24 h的荧光强度比其他组高2~3倍（图5b）。G5-PEG-5B组荷瘤鼠的肿瘤与正常组织荧光信号比率（TNR）在注射后显著增加，并在24 h达到3.5左右。相比之下，其他组的TNR在0.9~2.0范围内（图5c）。这进一步证实了用PEG-B对PDI-PLL-G5进行修饰，可提高PDI-PLL-G5的体内肿瘤靶向能力。经荧光PDI内核构建的功能化树状大分子，通过体内、外FL成像可评估PEG-B化的PDI-PLL-G5体内生物分布及肿瘤富集度，最重要的是G5-PEG-5B具有靶向4T1细胞和4T1肿瘤的特异性，能提供持久、稳定的FL成像信号，进行即时灵敏的荧光监测。![]()
图5 生物素靶向PDI-PLL-G5用于体内异种移植瘤成像。（a）静脉注射各材料后4T1荷瘤鼠的全身光学成像；（b）不同成像时间点下的肿瘤荧光信号定量分析；（c）不同成像时间点下的肿瘤与正常组织的TNR
Bukun等以荧光染料FITC为核心，通过重复与乙二胺进行迈克尔加成反应，再进一步与丙烯酸甲酯进行酰胺化反应，合成了一系列不同代数的以FITC为核心的PAMAM树状大分子（FITC-G0~ FITC-G5）。之后将过量的抗代谢类抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶（5-FU）与上述合成的以FITC为核心的PAMAM树状大分子混合，将5-FU负载到该树状大分子FL成像试剂中。基于FITC核心赋予的该树状大分子荧光特性，可通过荧光显微镜监测人胃癌AGS细胞对5-FU负载的PAMAM树状大分子（G0-G5）的摄取。用负载5-FU的FITC为核心的树状大分子处理AGS细胞4 h后，在荧光显微镜下通过FITC介导的FL成像观察细胞内化。结果发现，随着树状大分子代数的增加，细胞对该功能化树状大分子的内化从FITC-G0的（20.00% ± 2.45%）逐渐增加到FITC-G5的（39.00% ± 0.82%），表明细胞摄取、内化随树状大分子代数的增加而增加。负载5-FU的FITC-G2和FITC-G3处理AGS细胞4 h后，细胞对该功能化树状大分子的内化分别为22.27% ± 1.68%和（25.00% ± 1.22%）。FITC-G4被内化入细胞的比例（31.47% ± 0.41%）显著高于FITC-G3（25.00% ± 1.22%），FITC-G5被内化入细胞的比例（39.00% ± 0.82%）显著高于FITC-G4（31.47% ± 0.41%）。FL成像结果表明，PAMAM树状大分子以代数依赖性方式被AGS细胞所摄取，进而促进5-FU递送入细胞。该种以FITC为核心的PAMAM树状大分子在进行癌细胞FL成像的同时也能进行5-FU的高效递送，利用荧光信号的强弱分析功能化树状大分子对5-FU的递送效率。目前构建的荧光染料分子载入的树状大分子，能实现细胞及动物层面的FL成像。且其呈现的荧光信号及图像分辨率优于树状大分子自发荧光。更重要的是，树状大分子良好的水溶性及理化性质能显著改善荧光染料分子水溶性及光稳定性，可实现较长时间的FL成像，且在体内具有良好的生物安全性。然而荧光染料分子载入的树状大分子中，以物理包裹的形式将荧光染料分子载入到树状大分子内部，由于功能化树状大分子与荧光染料之间相互作用力的不足，易在未到达肿瘤部位前发生荧光染料分子泄露，且荧光染料分子在树状大分子中载入率低，导致低剂量FL成像试剂介导的FL成像信号较低。因此，如何增强树状大分子与荧光染料间的相互作用力，以及如何提高荧光染料分子在树状大分子中的载入率，仍需深入研究。常见的无机荧光纳米颗粒主要包括荧光量子点（QDs）和上转换纳米颗粒（UCNPs）等。QDs作为新一代的荧光标记物，其在紫外光辐照下可呈现不同波长荧光，基于其较小的粒径、较窄的荧光发射峰、较高的量子产率及亮度，相较于有机荧光染料，更易于在长时间内抵御光漂白。目前常见的QDs主要有银硫族（Ag2X；X = S，Se，Te）QDs、硒化镉/硫化锌（CdSe/ZnS）QDs和碳点（CDs）等。QDs具有更长的发射寿命和更强的荧光信号强度，如单个CdSe QDs的荧光发射强度是有机荧光染料罗丹明的20倍，但漂白速率仅为罗丹明的百分之一。UCNPs基于较高的光稳定性、检测灵敏度及光穿透深度，作为性能优良的FL成像试剂应用于生物医学。其主要成分为稀土元素掺杂的无机基质，如镧系氧化物（Ln2O3）等。稀土元素的能级结构决定了其存在将两个或两个以上的长波长低能近红外光子通过非线性辐射转化为短波长高能光子的能力，可明显增强对组织的光穿透深度，因而FL成像灵敏度较高。尽管QDs和UCNPs具有优异的光学性能，但其潜在的细胞毒性、较差的水溶性及缺乏组织特异性限制了其体内FL成像应用。而树状大分子与无机荧光纳米颗粒结合恰能弥补无机荧光纳米颗粒的诸多缺陷，可实现体内、外高效FL成像，近年来在肿瘤诊疗领域已广泛应用。银硫族（Ag2X；X = S，Se，Te）QDs作为窄带隙半导体纳米晶体，其稳定性高、量子产率高，且其具有独特的NIR-II区FL成像特性，广泛应用于癌症的生物医学诊断。Awasthi等制备了具有荧光特性的硫化银量子点（Ag2S QDs），并将其与聚乙二醇化聚酰基硫脲树状大分子（PEG-PATU）结合，得到PEG-PATU包裹Ag2S QDs（PEG-PATU Ag2S QDs）。其主要采用一锅法将硝酸银（AgNO3）添加到PEG-PATU溶液中，PEG-PATU通过与硫脲基团的配位促进银离子吸收至树状大分子核心中。随后，添加硫化钠（Na2S）触发PEG-PATU纳米笼中Ag2S纳米晶体的原位形成，最终形成PEG-PATU Ag2S QDs。基于PEG-PATU Ag2S QDs的荧光特性，可采用荧光显微镜进行细胞成像观察。PEG-PATU Ag2S QDs孵育肺癌A549细胞4 h后，细胞的荧光强度随着PEG-PATU Ag2S QDs浓度的增加而增加，并随着孵育时间的延长而趋于稳定，这表明A549细胞成功摄取PEG-PATU Ag2S QDs。用PEG-PATU Ag2S QDs标记的A549癌细胞进行体内细胞荧光示踪，可进一步探讨转移的肿瘤细胞在血液中的首次定位和二次分布。在808 nm激光照射下，将PEG-PATU Ag2S QDs标记的A549细胞尾静脉注射入BALB/c小鼠体内，然后在不同时间点进行NIR-Ⅱ区FL成像。结果表明，在注射后2 min肝脏出现荧光信号，但在24 h内信号逐渐消失，而体内其他组织部位逐渐变亮，表明A549细胞在全身重新分布。作为对照，将相同剂量的PEG-PATU Ag2S QDs静脉注射至健康BALB/c小鼠体内，在相同条件下进行FL成像。结果显示，PEG-PATU Ag2S QDs介导的FL成像信号主要局限于肝脏中，而小鼠体内其他部位仅观察到微弱的荧光信号，表明大部分PEG-PATU Ag2S QDs定位于肝脏。以上结果表明，PEG-PATU Ag2S QDs在体内具有优异的NIR-Ⅱ区FL成像性能，可用于高效标记和跟踪体内A549 癌细胞的迁移率，并描绘A549细胞的体内行为，为肺癌的转移提供前期活体诊断信息。基于较窄的发射带宽、较高的荧光量子产率和较长的荧光寿命，CdSe/ZnS QDs常用作荧光探针用于监测癌细胞，并进行肿瘤的早期FL成像。Li等以具有荧光特性的CdSe/ZnS QDs为模板，在其表面依次配位键合硫辛酸（LA）和肼（NH2NH2）功能化树状大分子（LA-Glu(G2)-NHNH2）、LA-甲氧基化聚乙二醇（LA-mPEG）、RGD-聚乙二醇-LA（RGD-PEG-LA），得到负载CdSe/ZnS QDs的RGD靶向PEG化树状大分子（T-PHDs）。最后，将DOX通过酸敏感腙键偶联到T-PHDs中的LA-Glu(G2)-NHNH2表面，得到负载CdSe/ZnS QDs的RGD靶向DOX偶联的PEG化树状大分子（T-DPHDs）（图6a）。同时，还合成了未经靶向试剂RGD-PEG-LA修饰的负载CdSe/ZnS QDs的DOX偶联的PEG化树状大分子（DPHDs）。基于CdSe/ZnS QDs的固有荧光，可利用T-DPHDs介导的FL成像实时监测原发肿瘤和转移瘤动态变化。由4T1荷瘤鼠体内FL成像可知，在注射后相同时间点下，与DPHDs相比，修饰有靶向分子RGD的T-DPHDs在肿瘤部位更快出现荧光信号且亮度更强。注射后24 h的离体肿瘤FL成像显示，经DPHDs和T-DPHDs处理后的荷瘤鼠离体肿瘤均具有荧光信号，且T-DPHDs处理的荷瘤鼠离体肿瘤荧光信号更高（图6b）。这表明RGD的主动靶向能力使T-DPHDs在4T1肿瘤部位以更快的速度积累且积累量更多。因此，T-DPHDs可作为靶向荧光探针用于αvβ3整合素过表达的原发肿瘤的监测。随后通过对荷瘤鼠肺部进行FL成像从而监测乳腺癌转移情况。由结果可知，向4T1荷瘤鼠静脉分别注射生理盐水、DPHDs和T-DPHDs后，在离体明场图像中清晰可见肺部肿瘤转移。通过评价DPHDs和T-DPHDs处理的荷瘤鼠离体肺组织和4T1原发肿瘤中的荧光分布可知，DPHDs在肺部表现出非特异性荧光信号，而T-DPHDs仅在肺部和原发4T1肿瘤部位表现出高强度的荧光信号，这意味着T-DPHDs具有监测肿瘤转移的潜力，可通过荧光信号监测肿瘤转移动态情况（图6c）。这种功能化树状大分子负载的CdSe/ZnS QDs，经树状大分子的引入改善了CdSe/ZnS QDs的水溶性，且经树状大分子的功能化修饰可赋予T-DPHDs靶向特异性，可利用CdSe/ZnS QDs荧光特性实现αvβ3整合素过表达原发肿瘤和转移瘤的有效监测。![]()
图6 （a）T-DPHDs的合成示意图；（b）4T1荷瘤鼠的体内荧光图像和原发肿瘤的离体荧光图像；（c）注射后24 h肺部的离体图像（白色箭头表示转移灶）
CDs是一种尺寸小于10 nm的量子点亚群，其具有与传统量子点相似的强发光和小尺寸特性，且其表面拥有众多官能团，使其易于进行修饰及偶联，这使CDs可与多种纳米材料结合发挥其荧光特性。Ma等将CDs与肽类树状大分子共价键合并负载DOX构建肿瘤诊疗体系。首先采用微波热解法以葡萄糖为碳源，通过与聚乙二醇200（PEG 200）混合制备了蓝色荧光CDs，并通过酰胺化反应将氨基-双硫键-氨基（NH2-S-S-NH2）修饰于CDs表面得到硫醇化CDs（CDs-SH）。随后，将N-叔丁氧羰基-N'-（2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基）-L-精氨酸和L-赖氨酸甲酯盐酸盐缩合制备的第1代肽类树状大分子（D-S-S-D）经巯基氧化反应与CDs-SH共价键合，并吸附DOX在CDs表面得到负载DOX的肽类树状大分子修饰的CDs复合物（CD-D/DOX）。最后，用两性离子聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯（pCBMA）包裹CD-D/DOX，得到两性离子功能化并负载DOX的肽类树状大分子包裹CDs复合物（pCBMA(CD-D/DOX)）。pCBMA具有的亲水性和低界面能可减少pCBMA (CD-D/DOX)的非特异性蛋白吸附。同时，肿瘤微环境（pH < 6.8）下，构建的pCBMA(CD-D/DOX)的表面电荷可从pH 7.4的负值（−1.62 mV）逆转为正值（+7.65 mV），能与带负电荷的癌细胞膜相互作用，提高癌细胞对其摄取。CDs优异的荧光特性赋予了pCBMA(CD-D/DOX)生物荧光成像功能，通过共聚焦显微镜可评估pCBMA(CD-D/DOX)的体外癌细胞摄取能力。pCBMA(CD-D/DOX)孵育4T1细胞2 h后，可观察到细胞质中明显的CDs蓝色荧光信号，孵育时间延长至6及16 h可在细胞质和细胞核中观察到明显的CDs荧光信号，且不同孵育时间点下4T1细胞中的CDs（蓝色）与DOX（红色）荧光均重叠，经CDs介导的荧光信号可示踪pCBMA(CD-D/DOX)在4T1细胞内的分布（图7）。这表明负载DOX的pCBMA(CD-D/DOX)可被4T1细胞内化并进入细胞核中发挥体外抗癌效应。且经CDs介导的体内FL成像可评估pCBMA(CD-D/ DOX)的组织分布及代谢，pCBMA(CD-D/DOX)或游离CDs处理4T1荷瘤鼠8 h后，离体肿瘤中均未发现来自于CDs的荧光信号，表明pCBMA(CD-D/ DOX)可安全代谢出体外。由此构建的pCBMA (CD-D/DOX)不仅能通过CDs介导的FL成像实现抗癌药物在体外的示踪，且可用于监测载体在荷瘤鼠体内分布及代谢。![]()
图7 4T1细胞经pCBMA(CD-D/DOX)处理后的FL成像图（比例尺为25 μm）
同样，Li等以4-氨基水杨酸（4-ASA）为前体，通过一步水热法处理合成了黄色荧光CDs（y-CDs）。同时，将P-糖蛋白（P-gp）抑制剂聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS）修饰于G5 PAMAM树状大分子表面形成G5-TPGS偶联物。之后以y-CDs为模板，将G5-TPGS与y-CDs部分共价偶联、部分静电吸附形成G5-TPGS包裹的y-CDs复合物（G5-TPGS@y-CDs），并将DOX物理包裹至G5-TPGS@y-CDs中，得到(G5-TPGS@y-CDs)- DOX。经由y-CDs所发出的黄色荧光可用于G5-TPGS@y-CDs的体外癌细胞示踪。体外癌细胞FL成像显示，孵育人乳腺癌阿霉素耐药MCF-7/ADR细胞6 h后，与PBS孵育的MCF-7/ADR细胞相比，(G5-TPGS@y-CDs)-DOX孵育的 MCF-7/ADR细胞可同时观察到y-CDs（黄色）和DOX（红色）的荧光，经由y-CDs介导的荧光信号可指示(G5-TPGS@y- CDs)-DOX在MCF-7/ADR细胞中的递送部位，也表明(G5-TPGS@y-CDs)-DOX能被MCF-7/ADR细胞内化。这表明G5-TPGS@y-CDs复合物能够负载DOX并运送至MCF-7/ADR细胞中，实现抗癌药物在耐药性癌细胞中的高效富集。此外，y-CDs呈现的荧光信号还可进一步评估超声靶向微泡破坏（UTMD）技术对(G5-TPGS@y-CDs)-DOX体内肿瘤部位富集度的影响。经体内FL成像示踪显示，经静脉注射6 h后，与y-CDs处理的荷瘤鼠相比，(G5-TPGS@y-CDs)- DOX处理的荷瘤鼠和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+ UTMD处理的荷瘤鼠肿瘤部位均观察到荧光信号，且(G5-TPGS@y-CDs)-DOX + UTMD处理的荷瘤鼠肿瘤处具有最强的荧光信号，这表明UTMD技术有效提高了(G5-TPGS@y-CDs)-DOX的肿瘤富集度。经由y-CDs介导的荧光信号可在(G5-TPGS@y- CDs)-DOX进行肿瘤治疗的同时监测其体内分布，其作为新型荧光探针有望实现FL成像指导下的耐药性肿瘤的化疗。镧系元素掺杂的纳米颗粒作为最常见的UCNPs，具有组织穿透深、无背景荧光噪声干扰、成像灵敏度高等优势，作为性能优良的FL成像试剂应用于癌症诊疗领域。以相同的方法将小分子化合物叶酸（FA）包裹在Ln2O3 NPs表面，制备了对比材料FA包裹Ln2O3 NPs（FA@Dy, Er, Tb oxide NPs）（图8a）。通过分析G4.5@Dy, Er, Tb oxide NPs和FA@Dy, Er, Tb oxide NPs孵育宫颈癌HeLa细胞后的荧光信号，可评价G4.5树状大分子和FA包裹的Ln2O3 NPs的体外HeLa细胞摄取能力。基于镧系元素介导上转换荧光特性和顺磁性，构建的G4.5@Dy, Er, Tb oxide NPs可用于癌细胞FL/MR双模态成像。最重要的是，树状大分子的引入赋予G4.5@Dy, Er, Tb oxide NPs较强的水溶性可实现HeLa细胞提升性FL成像，可用于早期癌细胞的双模态成像监测。图8 （a）FA和G4.5包裹混合镧系（Dy/Er/Tb）氧化物纳米颗粒的简易合成。（b）FA@Dy, Er, Tb oxide NPs（1）和G4.5@Dy, Er, Tb oxide NPs（2）孵育HeLa细胞24 h后的FL成像图目前构建的树状大分子负载的无机纳米荧光颗粒，由于功能化树状大分子的引入改善了无机纳米荧光颗粒的水溶性，提高了其生物相容性，基于树状大分子的可修饰性，可通过在其表面修饰聚乙二醇、靶向试剂、两性离子等功能试剂以提高 FL成像试剂在体内的血液循环时间和肿瘤处的聚集，并在体内、外呈现出灵敏、优异的FL成像性能。但树状大分子负载的无机纳米荧光颗粒在生命体内的应用目前仍然处于早期试验阶段，低浓度的树状大分子负载的无机纳米荧光颗粒在体内进行FL成像时并未有显著的病理反应，但其在体内的长期毒性仍无法明确。因此，对于树状大分子负载的无机纳米荧光颗粒在体内长期应用的生物毒性评估仍需深入研究，为探索荧光寿命更长且体内生物安全度更高的树状大分子负载的无机纳米荧光颗粒提供参考。
本文系统归纳了基于树状大分子的荧光成像试剂的制备及其在癌症生物医学领域的应用。详细阐述了自发荧光树状大分子、荧光染料分子及无机荧光纳米颗粒负载的树状大分子独特性质及其体内、外肿瘤成像监测应用。基于树状大分子良好的水溶性及生物相容性改善了小分子荧光探针的潜在毒性和光稳定性；在树状大分子表面修饰靶向特异性配体可实现肿瘤部位的高度富集，进而实现低浓度介导的高效荧光成像；得益于树状大分子的保护，可极大程度地避免荧光分子荧光猝灭，实现长时间荧光成像。通过总结树状大分子作为载体在合成荧光成像试剂中的作用，为早期癌症的诊断提供精确、全面的成像指导信息。
虽然目前已报道的各类基于树状大分子的荧光成像试剂明显改善了小分子荧光探针的诸多缺陷，但以物理包裹的形式将荧光染料分子载入到树状大分子内部，易在未到达肿瘤部位前发生荧光染料分子泄露；自发荧光的功能化树状大分子荧光效应易受多种因素（树状大分子代数、浓度及pH环境）干扰；这些因素仍然影响荧光成像效果。因此，设计开发性能优良的功能化树状大分子以减少以上因素对荧光成像效果的干扰将成为今后研究重点，为其推广应用至其他疾病的早期诊断奠定基础。· 编辑推荐 · Editor's Recommendation
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Authors: Linjie Yue, Lingxiu He, Na Liu, Risong Pan, Jingyi Zhu*Title: Synthesis and Cancer Biomedical Applications of Dendrimer-Based Fluorescence Imaging AgentsPublished in: Progress in Chemistry, 2024, 36(8), 1186-1199
