Nature、Science齐发！“类器官之父”团队最新力作：阐释肠内分泌细胞传感器于激素分泌的重要意义

肠内分泌细胞（EECs）是胃肠道（GI）上皮细胞的稀有类型（约占1%），构成肠-脑轴的关键部分，负责调节食欲、胰岛素释放、排便及粘膜免疫等代谢相关生理反应。EECs可细分为五种主要亚型：肠嗜铬细胞（EC）主要产生5-羟色胺（5-HT），调节肠道运动和炎症；L细胞分泌胰高血糖素样肽1（GLP-1）等多种激素；MX细胞产生胃饥饿素等；D细胞分泌生长抑素；K和G细胞则分别产生胃抑制蛋白和胃泌素。这些亚型在胃肠道中分布各异，K、MX和G细胞多在小肠近端，L细胞则在小肠远端和结肠富集。EECs具有电兴奋性，通过G蛋白偶联受体（GPCRs）和营养状态调节细胞内钙水平，进而控制激素分泌。其产物可通过扩散或与附近细胞突触相互作用传递信号。基于EEC生物学，药物开发主要聚焦于激素模拟物，如GLP-1和GIP衍生物，在治疗糖尿病和肥胖中显示潜力。由于EEC罕见，研究具有挑战性，但单细胞RNA测序（scRNA-seq）和肠道类器官平台为深入研究提供了可能。本研究致力于构建人体组织EEC单细胞转录图谱，并定义了22个传感器功能，结合描述性观察与功能性研究，推动了EEC研究的深入。

1、生成人胃类器官系，用scRNA-seq测试BMP对胃内分泌分化的影响；并构建全面内分泌细胞转录图谱。

2、在体内验证在类器官中发现的受体表达谱，探究GPCR在激素分泌中的功能。

1、胃类器官中内分泌细胞的分化

研究人员为了克服内分泌细胞在胃类器官中难以大量产生的难题，创建了携带强力霉素（DOX）诱导的NEUROG3表达构建体的人胃类器官系。在特定的培养条件（ENR）下，通过短暂过表达NEUROG3并随后进行不同时间段的成熟处理，成功诱导了细胞向主要胃内分泌谱系的分化，特别是肠嗜铬细胞（ECs）。这些内分泌细胞在成熟后展现出分泌功能，如透射电镜所示，它们在环腺苷3′，5′-单磷酸腺苷（cAMP）激动剂刺激下能够释放5-羟色胺（5-HT）和胃饥饿素（GHRL）。蛋白质组学分析进一步揭示了这些类器官产生的肽激素全谱，且仅在NEUROG3过表达时观察到内分泌产物的生成。同时，控制条件下粘液相关蛋白质如三叶因子富集。考虑到骨形态发生蛋白（BMP）对肠道激素表达的影响，研究人员通过批量RNA-seq评估了其对胃内分泌分化的作用，发现BMPs能改变内分泌产物的种类，如增加胃动素（MLN）表达而减少GHRL，并诱导神经肽NPW的表达，同时影响快速性激肽TAC3和粒蛋白的表达模式。最终，研究得出结论：NEUROG3足以产生除ECL细胞外的主要胃内分泌细胞系，且BMPs能类似于小肠（SI）那样修改其分泌产物的种类。（图1）

图1 人胃类器官向功能性内分泌细胞的分化。

2、胃和肠类器官中EEC亚型GPCR谱的描述

研究人员利用CRISPR-Cas9技术在激素的翻译终止密码子处引入荧光报告基因，以此追踪和纯化胃内分泌细胞系。通过免疫荧光染色验证，成功标记了CHGA、SST和GHRL等关键分子。随后，结合先前研究中建立的敲入类器官生物库，对来自14种不同细胞类型和区域身份的内分泌细胞进行了分类，并构建了全面的转录组图谱。RNA-seq分析不仅证实了预期激素在各自报告基因群中的表达模式，还揭示了多种已知GPCRs在各类内分泌细胞中的表达。更重要的是，该分析还发现了多个先前未知的内分泌细胞特异性受体基因，如黑寡妇毒素α-脂肪毒素受体（ADGRL1和ADGRL2）。此外，多巴胺受体DRD2和乙酰胆碱受体亚基CHRNB2在多数内分泌细胞亚群中均有表达。值得注意的是，在肠嗜铬细胞（ECs）和L细胞中，分别观察到丙氨酸受体GALR1和GALR2的表达，其中GALR1对GLP-1分泌有抑制作用，而GALR2则促进分泌。尽管两者均受神经肽丙氨酸调控，但GALR2对下丘脑产生的特定14肽丙氨酸有反应。此外，ECs还广泛表达脂肪酸受体和胆汁酸受体GPBAR1，表明它们对饮食成分有直接响应。（图2）

图2 确定胃、SI和结肠中人类EEC亚型的感觉体。

3、CD200引导的人原代EEC细胞单细胞图谱

研究人员进一步在体内验证了类器官中发现的受体表达谱，尽管内分泌细胞在肠道中极为稀少，难以在单细胞水平上进行分析。通过利用CD200作为胃肠道内分泌细胞的一般表面标志物，研究人员从人胃、小肠（SI）和结肠活检中分离出富含CD200和EPCAM的细胞，并采用新开发的VASA-seq方案进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），该方案能够获取全转录长度信息，从而增加了发现低表达受体基因的机会。由此生成了一个包含764个内分泌细胞和1314个非EEC上皮细胞的胃肠道上皮数据集，其深度和广度均超过了以往的人类内分泌细胞数据集。该数据集验证了大多数受体作为假定传感器的表达谱，并发现了降钙素受体CALCR在D细胞和ECs中的表达，尤其在ECL细胞中表达最高。同时，也证实了GLP1R在D细胞中的表达，并首次在ECL、MX和G细胞以及免疫调节簇细胞中检测到这种激素受体的表达。此外，MX细胞表达更高水平的色氨酸受体CASR。尽管类器官和组织数据之间存在细微差异，但大多数GPCR在两者中的表达是一致的。研究还观察到一群来自十二指肠的未知上皮细胞，高表达肽酶、GP2和GLP1R，可能代表布鲁纳腺细胞。

由于胃类器官模型无法产生ECL细胞，研究人员利用组织数据集来探索其分化的潜在调节因子。他们发现PTF1A过表达导致大量细胞凋亡和基质降解，伴随胰腺羧基肽酶CPA1的高表达，表明明显的腺泡转分化。此外，LHX5与NEUROG3联合时才能诱导HDC的表达，HDC是组胺合成的关键酶，也是ECL细胞的重要标志物，尽管表达水平相对较低。（图3）

图3 scRNA-seq和空间转录组学揭示了沿人类胃肠道的EEC传感器。

4、GPCR在激素分泌中的多重功能筛选

在确认类器官与组织内分泌细胞基因表达一致的基础上，研究人员利用类器官模型评估受体功能。他们通过胞嘧啶碱基编辑器构建了22个受体缺陷类器官系的生物库，包含370个类器官克隆。为提高实验敏感性，选择在夜间检测所有分泌物，并测试了已知通过GPBAR1调节GLP-1分泌的胆汁酸，发现GPBAR1突变体类器官中GLP-1分泌减少约50%。接着，用GPCR激动剂刺激整个类器官生物库，包括FFAR3、GALR2和TRPV2等未突变基因，并测量MX细胞富集的GHRL。结果揭示了多个控制GLP-1、5-HT和GHRL分泌的受体，如黑素皮质素受体MC1R，且ADGRL2突变仅部分影响这些效应，表明受体间存在功能冗余。此外，发现与2型糖尿病相关的ABCC8基因突变类似地控制了GLP-1和5-HT的肠道释放，这与先前在大鼠和小鼠细胞系中的发现一致，但与肠道外植体或患者中的观察结果不同，可能与测定灵敏度或体内间接影响有关。研究还表明，肠内皮细胞通过FFAR2、FFAR4和GPR119等多种受体对脂肪酸产生反应，而ECs在小鼠中无此反应，但GLP-1释放同样受这些受体调控。最后，测试了多巴胺受体在激素释放中的作用，发现多巴胺显著降低ECs的5-HT释放，主要由高表达的Gi偶联DRD2介导，且这种作用可被多种多巴胺受体抑制剂逆转，但抑制程度不同，反映了对不同受体的活性差异。（图4、5）

图4 用于功能验证的人类功能缺失GPCR生物库的生成。

图5 人EEC传感器的功能评估。

本研究开发了一个胃内分泌细胞分化平台，生成了胃肠道EEC群体补体的转录组数据集，并生成了一个聚焦受体突变生物库。因此，发现了EEC受体的功能，并发现了一些先前描述的基因的意想不到的功能。本研究还鉴定并验证了控制人类GLP-1释放的多种GPCR和通道蛋白，包括磺酰脲受体ABCC8和色氨酸敏感CasR。

目前的工作可以作为利用GPCR开发口服小分子的基础。基于CD200的富集可能会进一步研究与代谢性疾病相关的遗传变异，因为它可能导致EECs的表达变化。最后，肠上皮细胞上这种免疫检查点的存在是有趣的，未来的工作可能会解决它是否在控制组织驻留或其他免疫细胞的激活中起作用。

参考文献

Beumer J, Geurts MH, Geurts V, Andersson-Rolf A, Akkerman N, Völlmy F, Krueger D, Busslinger GA, Martínez-Silgado A, Boot C, Yousef Yengej FA, Puschhof J, Van de Wetering WJ, Knoops K, López-Iglesias C, Peters PJ, Vivié JA, Mooijman D, van Es JH, Clevers H. Description and functional validation of human enteroendocrine cell sensors. Science. 2024 Oct 18;386(6719):341-348. doi: 10.1126/science.adl1460. Epub 2024 Oct 17. PMID: 39418382.