肝癌继续是一个对人类健康构成威胁的重大全球健康问题。据估计，到2025年，受肝癌影响的人数将超过100万。肝癌中最常见的组织类型是肝细胞癌（HCC），占75%至80%。除了传统的手术治疗外，如CAR-T细胞疗法、免疫检查点抑制剂（ICIs）、酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）和抗体治疗等疗法有潜力延长患者生存期。然而，尽管有这些治疗选择，由于肿瘤的异质性，HCC仍然是一种不治之症。
采用CAR-T细胞转移是一种有效的策略，可以抑制肿瘤生长并延长患者生存期。CAR-T细胞由用于细胞外抗原结合的单链可变片段（scFv）、CD3细胞内信号域和其他细胞内共刺激信号域组成，包括CD28和4-1BB。CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗中仍面临几个挑战，包括缺乏有效的治疗靶点、肿瘤异质性、抑制性肿瘤微环境和抗原逃逸。为了解决这些问题，识别额外的肿瘤相关生物标志物以减少抗原逃逸并最大化CAR-T细胞的治疗效率是必要的。
糖蛋白3（GPC3）是一种在胎儿发育期间表达但在正常成人肝脏中严格被抑制的高度肿瘤相关抗原。在HCC中，超过70%的病例高水平表达GPC3，近90%的肝癌高水平表达GPC3。目前已经启动了一些针对GPC3 CAR-T细胞治疗HCC和肝癌患者的I期临床试验。尽管GPC3 CAR-T细胞显示出一些临床效果，但在治疗肝癌时仍面临一定的挑战，包括肿瘤异质性和抗原逃逸。有报道称GPC3会脱落，GPC3脱落会导致抗GPC3 CAR-T细胞在HCC治疗中反应不佳。因此，有必要开发一种避免因GPC3脱落而导致抗原逃逸的CAR-T细胞疗法。
成纤维细胞激活蛋白（FAP）是由成纤维细胞分泌的II型跨膜丝氨酸蛋白酶。在正常组织中，FAP重塑细胞外基质以允许组织重塑。针对FAP的CAR-T细胞已被用于治疗心脏损伤。在肝癌发生中，FAP促进早期肝损伤中的纤维化、肿瘤细胞增殖和免疫抑制，在促进HCC的发展中扮演着重要角色。针对HCC中的FAP可能增强CAR-T细胞的抗肿瘤效果。
作者团队提出了一种新型的CAR-T细胞设计，该细胞构建了两个scFv，同时针对GPC3和FAP，以扩展CAR-T细胞疗法到额外的适应症和肿瘤抗原。双特异性CAR-T细胞能够通过同时针对GPC3和FAP在体外识别和杀死HCC细胞，表明GPC3 scFv和FAP scFv都能够与肿瘤抗原相互作用并传递下游信号。与GPC3 CAR-T和FAP CAR-T细胞相比，双特异性CAR-T细胞在对抗高表达GPC3或FAP的HCC方面显示出显著的疗效增加。体内研究揭示了这些双特异性CAR-T细胞抑制HCC肿瘤生长并延长了荷瘤小鼠的生存期，提供了它们能够预防抗原逃逸和控制异质性HCC的证据。
图1展示了FAP和GPC3在肝细胞癌（HCC）中的高表达及其与患者预后的关联。图A和图B通过GEO数据库的数据表明，与正常组织相比，HCC患者肿瘤组织中FAP和GPC3的表达显著升高。图C和图D的Kaplan-Meier生存曲线分析显示，FAP和GPC3的高表达与HCC患者较差的预后相关。图E通过流式细胞术确认了HepG2、SNU387和SNU398这三种HCC细胞系中FAP和GPC3的高表达，支持了这两种蛋白作为HCC治疗靶点的潜力。
图2展示了针对FAP和GPC3的双特异性CAR-T细胞的生成和特性分析。图A展示了FAP CAR、GPC3 CAR和FAP-GPC3 CAR的结构示意图。图B通过流式细胞术分析了CAR-T细胞中CAR的表达情况，显示了MOCK-T、FAP CAR-T、GPC3 CAR-T和FAP-GPC3 CAR-T细胞的CAR表达水平。图C展示了转染后CAR-T细胞的增殖情况，与MOCK-T细胞相比，CAR-T细胞的增殖情况相似。图D和图E通过流式细胞术检测了用不同肿瘤细胞刺激后FAP-GPC3 CAR-T细胞上CD25和CD69的表达，结果显示，与单一靶点的CAR-T细胞相比，双特异性CAR-T细胞在与SNU398细胞共培养后表现出更高的CD25和CD69表达水平，表明它们能够识别FAP和/或GPC3并激活其功能。图F统计了图E的数据，显示了不同CAR-T细胞类型中CD25和CD69双阳性T细胞的百分比，其中FAP-GPC3 CAR-T细胞显示出显著更高的双阳性细胞比例，证实了双特异性CAR-T细胞的高效激活。这些结果表明，FAP-GPC3 CAR-T细胞能够识别并激活针对HCC细胞的抗肿瘤反应。
图3展示了FAP-GPC3双特异性CAR-T细胞对HCC细胞的体外细胞毒性。通过基因改造表达GFP-荧光素酶的三种HCC细胞系（HepG2、SNU387和SNU398）用于评估CAR-T细胞的细胞毒性。实验中，CAR-T细胞与肿瘤细胞以特定的效应T细胞与肿瘤细胞（E:T）比例共同培养。结果显示，FAP-GPC3 CAR-T细胞对HepG2细胞的细胞毒性与GPC3 CAR-T细胞相似，而FAP CAR-T细胞的细胞毒性显著低于FAP-GPC3 CAR-T细胞和GPC3 CAR-T细胞，但高于MOCK-T细胞。此外，FAP-GPC3 CAR-T细胞在与SNU387和SNU398细胞共培养后，表现出与FAP CAR-T细胞相似的细胞毒性，并且能够分泌较高水平的细胞因子，如IFN-γ、GZMB、TNF-α和IL-2。这些结果表明，FAP-GPC3 CAR-T细胞能够特异性识别并杀死表达FAP、GPC3或两者兼有的癌细胞，并在体外对FAP-GPC3双阳性癌细胞展现出强大的细胞毒性。
图4展示了FAP-GPC3双特异性CAR-T细胞在体内对HepG2细胞衍生的异种移植（CDX）模型的抗肿瘤效果。图A描述了动物实验的示意图，其中HepG2细胞被移植到NSI小鼠中，然后在肿瘤可触及时给予MOCK-T细胞、FAP CAR-T细胞、GPC3 CAR-T细胞和FAP-GPC3 CAR-T细胞。图B显示了治疗后肿瘤体积的测量结果，FAP-GPC3 CAR-T细胞相比其他细胞类型显示出更优越的抗肿瘤效果。图C的Kaplan-Meier生存曲线表明，FAP-GPC3 CAR-T细胞显著延长了小鼠的生存期。图D展示了通过流式细胞术检测的HepG2 CDX模型小鼠外周血中人类T细胞的浸润比例，而图E显示了小鼠的体重变化。这些结果表明，FAP-GPC3 CAR-T细胞在体内对HepG2肿瘤生长有显著的抑制作用，并且具有良好的安全性。
图5展示了FAP-GPC3双特异性CAR-T细胞在体内对SNU398细胞系衍生的异种移植（CDX）模型的抗肿瘤效果。图A描述了动物实验的示意图，其中SNU398细胞被移植到小鼠中，然后在肿瘤可触及时给予MOCK-T细胞、FAP CAR-T细胞、GPC3 CAR-T细胞和FAP-GPC3 CAR-T细胞。图B显示了治疗后肿瘤体积的测量结果，FAP-GPC3 CAR-T细胞相比其他细胞类型显示出更显著的肿瘤生长抑制效果。图C的Kaplan-Meier生存曲线表明，FAP-GPC3 CAR-T细胞显著延长了小鼠的生存期。图D展示了通过流式细胞术检测的SNU398 CDX模型小鼠外周血中人类T细胞的浸润比例，而图E显示了小鼠的体重变化。这些结果表明，FAP-GPC3 CAR-T细胞在体内对表达FAP或GPC3的肿瘤具有强大的抗肿瘤效果，并且是安全的。总之，FAP-GPC3 CAR-T细胞不仅有效抑制了HepG2肿瘤的生长，也有效抑制了SNU398肿瘤的生长，表明它们在对抗具有异质性抗原的HCC肿瘤中可能具有强大的作用。
图6展示了FAP-GPC3双特异性CAR-T细胞对来源于肝癌患者的异种移植（PDX）肿瘤模型的强效抗肿瘤活性。图A描述了动物实验的示意图，其中患者来源的组织被移植到NSI小鼠中，7天后通过肿瘤周围注射CAR-T细胞，并每3天测量一次肿瘤体积。图B显示了治疗后肿瘤体积的测量结果，与MOCK-T细胞、FAP CAR-T细胞、GPC3 CAR-T细胞相比，FAP-GPC3 CAR-T细胞明显抑制了PDX肿瘤的生长。图C的Kaplan-Meier生存曲线表明，与MOCK-T细胞相比，CAR-T细胞显著延长了小鼠的生存期。图D展示了通过流式细胞术检测的PDX模型小鼠外周血中人类T细胞的比例，而图E显示了CAR-T细胞输注后小鼠体重的变化。这些结果表明，FAP-GPC3 CAR-T细胞在表达FAP和GPC3的PDX模型中表现出强大的抗肿瘤效果，并且显示出良好的安全性。总之，FAP-GPC3 CAR-T细胞在来源于肝癌患者的肿瘤中比FAP CAR-T细胞和GPC3 CAR-T细胞更有效地抑制了肿瘤生长。
总的来说，文章报道了研究团队开发的一种治疗肝细胞癌（HCC）的新型的双特异性CAR-T细胞疗法。开发的是一种能够同时靶向成纤维细胞激活蛋白（FAP）和糖蛋白3（GPC3）的CAR-T细胞，这两种蛋白在HCC中的表达水平较高，并与患者的预后不良相关。通过体外实验和体内动物模型，研究者发现这种双特异性CAR-T细胞对HCC细胞系和患者来源的肿瘤具有显著的细胞毒性和抗肿瘤效果。与单一靶点的CAR-T细胞相比，双特异性CAR-T细胞在抑制肿瘤生长和延长生存期方面表现出更优效性。此外，这种新型CAR-T细胞疗法在实验中也显示出良好的安全性。这些发现表明，针对FAP和GPC3的双特异性CAR-T细胞疗法可能为HCC患者提供一种新的有效治疗选择，特别是对于表达这两种抗原的异质性肿瘤。
