光热治疗联合降解肿瘤细胞周围基质治疗三阴性乳腺癌的实验研究

张洁, 李阳, 唐玉霞, 等.  光热治疗联合降解肿瘤细胞周围基质治疗三阴性乳腺癌的实验研究[J]. 中华肿瘤杂志, 2023, 45(11):926-933. DOI:10.3760/cma.j.cn12152-20221108-00747.

 摘   要 

目的

探讨降解肿瘤细胞周围基质对聚乙二醇修饰的金纳米星(GNS－PEG)肿瘤递送及三阴性乳腺癌光热治疗疗效的影响。

方法

构建GNS－PEG颗粒，观察其理化特征并检测其光热性能。在细胞水平检测常山酮(HF)和光热治疗的细胞毒性。于BALB/c裸鼠皮下接种4T1细胞建立三阴性乳腺癌小鼠模型。经尾静脉注射5次HF(HF组)，对肿瘤组织切片行马松染色及转化生长因子β1(TGFβ1)、α－平滑肌肌动蛋白(α－SMA)、CD31免疫组化染色，观察肿瘤基质降解效果。经尾静脉注射5次HF后再注射GNS－PEG(HF+GNS－PEG组)，采用电感耦合等离子体质谱法测定肿瘤组织中GNS－PEG的含量。以近红外激光照射GNS－PEG组和HF+GNS－PEG组小鼠的肿瘤部位，用红外摄像机记录温度变化。观察各组小鼠的肿瘤生长和体重变化情况。对各组小鼠的肿瘤组织切片行Ki－67免疫组化染色、原位末端转移酶标记染色和HE染色，观察肿瘤增殖、凋亡及坏死情况。对各组小鼠的心、肝、脾、肺及肾组织切片行HE染色，观察细胞形态变化。

结果

成功构建了具有多枝结构的GNS－PEG颗粒，粒径为73.5 nm。GNS的吸收峰为810 nm，处于近红外区。GNS－PEG的光热转换率高达79.3%，并且可以通过激光能量控制光热效果。HF具有浓度依赖的细胞毒性，当HF浓度达1000 nmol/L时，4T1细胞存活率低至(22.8±2.6)%。GNS－PEG的光热作用对4T1细胞杀伤效果显著，当浓度达25 pmol/L时，细胞存活率为(32.7±5.2)%。HF组小鼠肿瘤组织中胶原蛋白容积分数、TGFβ1积分光密度和α－SMA积分光密度分别为(2.1±0.2)%、3.1±0.4、5.2±1.9，均低于对照组(均P<0.01)，血管直径为(8.6±2.9)μm，高于对照组(P<0.05)。HF+GNS－PEG组小鼠肿瘤组织中金元素浓度为52.4 μg/g，高于GNS－PEG组(15.9 μg/g，P<0.05)。激光照射后，HF+GNS－PEG组小鼠肿瘤部位的温度明显高于GNS－PEG组，第4 min时，GNS－PEG组和HF+GNS－PEG组小鼠肿瘤部位温度分别为51.5 ℃和57.7 ℃；HF+GNS－PEG组小鼠的肿瘤体积得到有效抑制。各组小鼠的体重在监测期间未发生显著变化。GNS－PEG组小鼠的主要脏器未见明显异常，但HF组和HF+GNS－PEG组可见部分肝细胞水肿、变性。

结论

降解三阴性乳腺癌的肿瘤细胞周围基质能明显改善GNS－PEG的肿瘤递送，提高光热治疗疗效。

【关键词】三阴性乳腺肿瘤; 细胞周围基质; 常山酮; 金纳米星; 光热治疗; 药物递送

纳米颗粒介导的光热治疗是近年来微创治疗乳腺癌的新方法。但乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌，含有大量的肿瘤细胞周围基质(extracellular matrix, ECM)，严重影响纳米颗粒递送及治疗效果。常山酮(halofuginone, HF)能够从多方面减少肿瘤ECM，包括抑制Ⅰ型胶原蛋白基因的表达、抑制转化生长因子β(transforming growth factor－β，TGFβ)通路及降低α－平滑肌肌动蛋白(α－smooth muscle actin, α－SMA)阳性肌成纤维细胞的活性等。因此，HF是用于联合纳米治疗的理想药物。金纳米星(gold nanostar, GNS)是呈多枝样结构的纳米颗粒，其局域等离子体带位于近红外区，光学性质易于调控，具有良好的光热性能，在光热治疗中是较理想的光热转换剂。在本研究中，我们以三阴性乳腺癌细胞系4T1构建裸鼠皮下肿瘤模型，先用HF减少ECM以利于纳米药物的递送，再注射聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修饰的GNS(GNS－PEG)进行光热治疗，旨在探索三阴性乳腺癌及其他ECM较为丰富实体肿瘤的纳米治疗新策略。

材料与方法

一、材料

1．细胞系：

鼠源性三阴乳腺癌细胞4T1，购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。

2．实验动物：

BALB/c裸鼠32只，雌性，6周龄，18~20 g，购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司。

3．主要试剂：

氯金酸(HAuCl4)、HCl、AgNO3、柠檬酸三钠(C6H5Na3O7)及抗坏血酸购自国药集团上海试剂有限公司。甲氧基封端的巯基聚乙二醇(SH－PEG－M)购自上海西宝生物科技有限公司。HF购自上海源叶生物科技有限公司。抗α－SMA、CD31以及TGFβ1抗体购自英国Abcam公司。四甲基偶氮唑蓝[3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5－dipheny－ltetrazolium bromide, MTT]购自美国Sigma－Aldrich公司。RPMI 1640培养基、热灭活胎牛血清、二甲基亚砜和0.05%胰酶－乙二胺四乙酸购自美国Gibco公司。

4．主要仪器：

Talos F200X透射电镜为美国FEI公司产品，UV－3600紫外－可见－近红外分光光度计为岛津企业管理(中国)有限公司产品，ZetaPALS分析仪为美国Brookhaven公司产品，220s红外摄像机为中国飞础科软件技术(上海)有限公司产品，7700电感耦合等离子体光学发射光谱仪/质谱仪为安捷伦科技(中国)有限公司产品。

二、实验方法

1．制备GNS－PEG：

采用种子介导法。将0.01 mol/L的HAuCl4溶液2.5 ml加入97.5 ml纯水中，加热至沸腾。在磁力搅拌(900 r/min)的同时，加入1%柠檬酸三钠水溶液3 ml，继续加热10 min。冷却至室温，即得到种子液(直径约14 nm)。将12 mol/L HCl 5 μl、0.01 mol/L HAuCl4 0.5 ml及种子液80 μl加入20 ml纯水中。在强烈搅拌下，将0.1 mol/L抗坏血酸100 μl与0.01 mol/L AgNO3 160 μl同时加入上述溶液中。30 s后，溶液颜色由浅红色变为蓝黑色，表明GNS已经形成。加入5 mmol/L SH－PEG－M 100 μl，继续搅拌2 h以修饰GNS。9000 r/min离心20 min收集GNS－PEG，于4℃冰箱保存备用。

2．GNS－PEG的表征观察与检测：

通过透射电镜观察GNS－PEG的形貌和结构，应用紫外－可见－近红外分光光度计测定GNS的吸收光谱，应用ZetaPALS分析仪测定GNS及GNS－PEG水动力学尺寸及zeta电位，通过红外摄像机拍摄热像图并记录GNS－PEG在激光照射过程中的时间－温度变化。

3．GNS－PEG的光热性能测试：

使用808 nm激光器，以不同强度(0.5、1.0和1.5 W/cm2)的激光分别照射0.1 nmol/L GNS－PEG 5 min，用红外摄像机记录溶液的温度变化，以1.5 W/cm2激光照射纯水作为对照，绘制时间－温度变化曲线。使用808 nm激光器，以1.0 W/cm2的激光照射0.05 nmol/L GNS－PEG 7 min。当温度稳定在最高温之后，自然冷却至室温，计算光热转化率。光热转化率＝[hS(T－T)－Q0]/[I(1－10－A)]×100%，其中h为水的导热系数，S为光照射面积，T为平衡温度，T为环境温度，Q0为石英比色皿的热传导功率(10.9 mW)，I为激光强度，A为标准光程(1 cm)下GNS－PEG在808 nm处的吸光度。

4．细胞毒性实验：

将4T1细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养24 h。(1)检测HF的细胞毒性：将各孔原培养基换为200 μl含有不同浓度(0、31、62、125、250、500和1000 nmol/L)HF的培养基，孵育48 h后检测细胞活性。(2)检测光热治疗的细胞毒性：将各孔原培养基换为200 μl含有不同浓度(0、3、6、12和25 pmol/L)GNS－PEG的培养基，孵育细胞48 h后，检测细胞活性。将各孔原培养基换为200 μl含有不同浓度(0、3、6、12和25 pmol/L)GNS－PEG的培养基，孵育细胞24 h后，使用808 nm激光器，以0.5 W/cm2的激光照射各孔5 min，检测细胞活性。每组均设置3个复孔。

细胞活性检测均采用MTT法。弃去培养基，每孔用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)清洗2遍，弃去PBS，在每孔中加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，避光孵育4 h。弃去MTT溶液，每孔加入100 μl DMSO溶液，振荡混匀10 min。使用酶标仪检测每孔570 nm处的吸光度。细胞活性＝实验组吸光度的平均值/对照组吸光度的平均值×100%。

5．建立三阴乳腺癌小鼠模型：

制备4T1细胞悬液，调整细胞密度为3×106个/ml。于BALB/c裸鼠右后肢背部皮下接种4T1细胞悬液，每只0.1 ml。

6．肿瘤组织中胶原蛋白、TGFβ1和α－SMA含量及血管直径的检测：

取6只BALB/c裸鼠建立4T1细胞三阴乳腺癌模型，分为对照组和HF组，每组3只。HF组小鼠经尾静脉注射75 μg/ml HF，每只200 μl，每3 d给药1次，共给药5次。对照组小鼠以相同的方式注射等体积生理盐水。收集肿瘤样本，切片，行马松染色及TGFβ1、α－SMA、CD31免疫组化染色。每张切片随机选取5个感兴趣区，计算胶原蛋白容积分数及TGFβ1和α－SMA的积分光密度(integrated optical density, IOD)。对于CD31染色的切片，每张切片至少测量20条血管的直径。

7．肿瘤组织中GNS－PEG含量的检测：

另取6只BALB/c裸鼠建立4T1细胞三阴乳腺癌模型，分为对照组和HF组，每组3只。HF组小鼠经尾静脉注射75 μg/ml HF，每只200 μl，每3 d给药1次，共给药5次。对照组小鼠以相同的方式注射等体积生理盐水。然后，各组小鼠尾静脉注射5 mg/ml GNS－PEG，每只200 μl。24 h后，收集完整肿瘤，称重后剪碎，加入王水消化溶解标本，加入超纯水稀释，使其王水含量低于5%，10000 r/min离心5 min，取上清液，即获得待测溶液。采用电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma－mass spectrometry, ICP－MS)测定溶液中金元素的含量，以金元素的含量代表GNS－PEG的含量，评价肿瘤对GNS－PEG的摄取情况。

8．治疗效果评估：

将20只BALB/c裸鼠分为对照组、HF组、GNS－PEG组和HF+GNS－PEG组，每组5只。HF组和HF+GNS－PEG组小鼠经尾静脉注射75 μg/ml HF，每只200 μl，每3 d给药1次，共给药5次。对照组和GNS－PEG组小鼠以相同的方式注射等体积生理盐水。GNS－PEG组和HF+GNS－PEG组小鼠于治疗开始后第16天经尾静脉注射5 mg/ml GNS－PEG，每只200 μl；第17天在小鼠肿瘤部位施以808 nm、0.4 W/cm2的激光照射5 min，每组选取1只小鼠用红外摄像机记录肿瘤部位的温度变化，获取热像图。对照组和HF组小鼠第16天经尾静脉注射等量生理盐水，之后不予激光照射。第18天，每组取1只小鼠处死，剖取肿瘤，行Ki－67免疫组化染色、原位末端转移酶标记(TdT－mediated dUTP nick－end labeling, TUNEL)染色及HE染色，观察肿瘤增殖、凋亡及坏死情况。肿瘤坏死率＝肿瘤的坏死面积/肿瘤的总面积×100%。各组的其他小鼠每3 d测量1次体重及肿瘤大小，共监测27 d。

9．生物安全性评估：

疗效评估实验的4组小鼠监测结束后，收集小鼠的心、肝、脾、肺及肾，切片，行HE染色，观察细胞形态变化。

三、统计学方法

应用R 3.5.1软件进行统计分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准α＝0.05。

结  果

1．GNS－PEG的理化特征：

透射电镜下可见，合成的GNS－PEG呈多枝样结构(图1)，表明成功合成了GNS－PEG。分光光度计检测结果显示，GNS有1个较宽的紫外－可见－近红外吸收峰，峰值在810 nm左右(图2)。粒径分析显示，GNS的粒径为(65.9±2.2)nm，粒径较小；GNS－PEG的粒径为(73.5±1.4)nm，比GNS粒径大，表明PEG成功修饰在GNS上。GNS和GNS－PEG的Zeta电位分别为(－33.0±1.5)mV和(0.0±0.9)mV，二者的差别进一步表明PEG成功修饰在GNS上。

2．GNS－PEG的光热性能：

时间－温度曲线显示，GNS－PEG的光热能力具有能量依赖性(图3)。GNS－PEG的光热转化率高达79.3%(图4)。

3．肿瘤细胞的杀伤效果：

0、31、62、125、250、500、1000 nmol/L HF处理4T1细胞后，细胞活性分别为(99.9±9.0)%、(99.9±3.9)%、(87.4±10.4)%、(54.1±7.3)%、(31.2±8.3)%、(25.7±2.9)%和(22.8±2.6)%，表明HF能抑制4T1细胞的活性，且有剂量依赖性。在暗环境中，0、3、6、12、25 pmol/L GNS－PEG处理4T1细胞后，细胞活性分别为(100.0±9.7)%、(102.7±6.4)%、(101.0±8.5)%、(93.9±12.6)%、(98.7±3.2)%和(99.1±2.5)%，细胞存活率均在90%以上。而在近红外激光的照射下(808 nm，0.5 W/cm2，5 min)，0、3、6、12、25 pmol/L GNS－PEG处理4T1细胞后，细胞活性分别为(100.0±9.6)%、(89.2±0.2)%、(74.2±11.2)%、(50.0±9.9)%和(32.7±5.2)%，表明GNS－PEG的光热治疗作用有剂量依赖性。

4．HF的降基质作用：

与对照组相比，HF组小鼠肿瘤内胶原蛋白的含量明显减少，肿瘤组织变得疏松，细胞间隙增大；TGFβ1和α－SMA的表达被明显抑制；HF组的肿瘤血管直径相对较宽(图5，表1)。以上结果表明，HF能够从多方面降解基质成分，有望提高纳米药物的瘤内递送。

5．GNS－PEG的体内分布：

ICP－MS检测结果显示，GNS－PEG主要分布在网状内皮系统(肝和脾)及肿瘤中(表2)。HF治疗后，肿瘤组织中的金元素浓度从15.9 μg/g升高到52.4 μg/g(P<0.05)，表明HF治疗后肿瘤组织对GNS－PEG的摄取显著增强。

6．治疗效果的评估：

热像图显示，GNS－PEG给药后，GNS－PEG组和HF+GNS－PEG组小鼠肿瘤部位的温度在激光照射下迅速升高，且HF+GNS－PEG组的温度升高更明显；第4 min时，GNS－PEG组和HF+GNS－PEG组肿瘤部位温度分别为51.5 ℃和57.7 ℃(图6)。

治疗后第18天(激光照射后第2天)，免疫组化检测显示，HF组、GNS－PEG组和HF+GNS－PEG组小鼠肿瘤组织中Ki－67的表达水平均低于对照组；TUNEL染色显示，HF组、GNS－PEG组和HF+GNS－PEG组小鼠肿瘤组织中细胞凋亡水平均上升，其中HF+GNS－PEG组上升最明显；HE染色显示，与对照组相比，HF在一定程度上可以促进肿瘤坏死，光热治疗后肿瘤组织坏死明显，且HF+GNS－PEG组肿瘤组织坏死最为严重(图7)。GNS－PEG组和HF+GNS－PEG组的肿瘤坏死率分别为83.67%和86.98%。对照组、HF组、GNS－PEG组和HF+GNS－PEG组的肿瘤坏死率分别为8.93%、12.88%、83.67%和86.98%。

从给药第18天起，HF组、GNS－PEG组和HF+GNS－PEG组小鼠的肿瘤体积均小于对照组，其中单纯HF治疗虽然在一定程度上抑制了肿瘤的生长速度，但是并未逆转肿瘤的生长趋势；GNS－PEG的光热治疗却使肿瘤体积明显减小，但在后续的监测过程中肿瘤体积又继续增大；HF+GNS－PEG组的肿瘤抑制效果最好，肿瘤生长被稳定抑制，肿瘤体积在后续监测过程中未再明显增大(图8)。

7．生物安全性评估：

HF组、GNS－PEG组、HF+GNS－PEG组和对照组小鼠的体重在监测过程中均未发生明显变化(图9)。与对照组相比，GNS－PEG组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器未见明显异常，但HF组和HF+GNS－PEG组可见部分肝细胞水肿、变性(图10)。

讨  论

光热治疗是一种将光能转化为热能的非侵入性恶性肿瘤治疗技术，已被用于前列腺癌的Ⅱ期临床试验中。金纳米颗粒是PPT常用的光热转化剂。我们在本研究中合成的GNS－PEG呈多枝样结构，其吸收峰可稳定地控制在810 nm，位于近红外Ⅰ区(650~900 nm)，有较高的组织穿透深度，可用于深部肿瘤的治疗。在近红外光的照射下，GNS－PEG的光热转化率高达79.3%，其在808 nm激光照射下，通过光热效应对4T1细胞活性产生了明显的抑制效果。

乳腺癌通常含有大量的ECM，阻碍纳米颗粒进入肿瘤深部，严重影响光热治疗的疗效。有研究表明，抑制TGFβ通路是降解ECM的有效方法。Liu等曾用TGFβ抑制剂降低乳腺癌内的ECM含量，并改善盐酸多柔比星脂质体的瘤内分布。在本实验中我们观察到，HF作为一种常用的TGFβ抑制剂，不仅具有一定的肿瘤杀伤效果，还能够明显抑制乳腺癌移植瘤中TGFβ的表达及其下游基因α－SMA的活化，进而降低ECM中胶原蛋白的含量，使乳腺癌移植瘤组织疏松，细胞间隙增大，肿瘤血管直径增大。ICP－MS检测结果显示，HF+GNS－PEG组肿瘤组织中的金元素浓度是GNS－PEG组的3.3倍。相应地，在光照治疗中，HF+GNS－PEG组肿瘤温度高于GNS－PEG组，且其对肿瘤生长的抑制最明显，能显著促进肿瘤凋亡及坏死。以上结果表明，HF可能是通过抑制TGFβ通路，抑制肌成纤维细胞的活化，使肿瘤胶原蛋白明显减少，从而减小ECM压力，扩张受压的肿瘤血管，改善GNS－PEG在乳腺癌移植瘤中的递送效率，最终提高PPT的治疗效果。

金是一种惰性金属，化学性质稳定。大量研究表明，金纳米颗粒具有良好的生物安全性，不会产生明显的不良反应。本研究结果也显示，GNS－PEG在暗环境下浓度高达25 pmol/L时，细胞存活率仍在90%以上。在GNS－PEG治疗组，小鼠体重未发生明显变化，主要脏器亦未观察到异常改变。但HF治疗组小鼠可观察到部分肝细胞发生水肿、变性，这可能与肝细胞的TGFβ通路被抑制有关。GNS－PEG+HF组的肝组织切片表现与HF组相仿，表明GNS－PEG与HF联用不会增加肝毒性。在后续的研究中，我们将致力于筛选更安全的ECM降解药物，或将HF装载到靶向肿瘤的纳米载体上，以进一步减小HF的肝毒性。

综上所述，降解ECM可以显著提高GNS－PEG的瘤内递送，抗TGFβ通路联合光热治疗能够明显改善三阴性乳腺癌的治疗效果。