膀胱癌（BC）是全球第十大最常诊断的恶性肿瘤，每年有约573000例新发病例和212000例死亡。嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是一种有前景的癌症治疗方法。但它在膀胱癌（BC）中的应用仍然有限，部分原因是缺乏适当的靶分子。唾液酸化的癌症衍生的IgG（SIA-CIgG）在BC中高度表达，并且与恶性生物学行为密切相关。目前其作为CAR-T细胞疗法治疗BC的靶点潜力尚未建立。作者团队发现SIA-CIgG在大多数BC样本中高度表达，但在正常组织中表达有限。在本研究中，作者团队构建和优化了特异性靶向唾液酸化癌症衍生IgG（SIA-CIgG）的CAR-T细胞。评估肿瘤清除后CAR-T细胞的细胞裂解效率、细胞因子分泌水平、免疫表型、转录组和染色质谱。研究表明SIA-CIgG CAR T细胞在体内治疗膀胱癌（BC）有效，伏立诺他可以提高抗肿瘤作用。
图1提供了膀胱癌（BC）组织和正常组织中SIA-CIgG表达的直观展示。研究发现，大多数膀胱癌组织中SIA-CIgG高度表达，而在多数正常组织中表达较少或未检测到。具体来说，大约四分之三的膀胱癌组织表现出SIA-CIgG的表达，其中31.7%表现为低表达，17.5%为中等表达，25.4%为高表达。相比之下，在17个正常膀胱组织样本中，47.1%未检测到SIA-CIgG，其余样本仅显示低表达。此外，尽管在某些组织（如输尿管、乳腺、扁桃体、前列腺和皮肤）中检测到低水平的SIA-CIgG表达，但在关键器官（如心脏、肺、脾、肾）中几乎未检测到SIA-CIgG。这些结果强调了SIA-CIgG作为膀胱癌潜在治疗靶点的特异性。
图2中的内容概述了CAR-T细胞的制备过程和功能评估。图a展示了CAR-T细胞生产和评估细胞毒性效应的流程图。图b是针对SIA-CIgG的CAR结构的示意图，显示了基于不同的变量重链和轻链（VH-VL/VL-VH）配置以及共刺激域（4-1BB或CD28）构建的四种CAR结构。图c评估了慢病毒感染后48小时的T细胞转导效率，通常在20-50%之间。图d在体外培养约2周后，确定了CAR-T细胞群体中CD4+和CD8+ T细胞的比例，其中CD8+ T细胞约占总细胞群体的80%。图e和f评估了CAR-T细胞群体中不同T细胞亚群的表面表达，包括未激活的T细胞（Tn）、中央记忆T细胞（Tcm）、效应记忆T细胞（Tem）和效应T细胞（Teff）。结果显示，未激活的T细胞（Tn）和效应记忆T细胞（Tem）的数量高于中央记忆T细胞（Tcm）和效应T细胞（Teff）。这些数据提供了对CAR-T细胞组成的深入了解，并对评估其潜在的治疗效果至关重要。
图3中的内容展示了SIA-CIgG CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。首先，通过免疫荧光染色确认了5637细胞系在细胞膜上强表达SIA-CIgG（图a）。接着，进行了细胞毒性实验，评估了四种CAR-T细胞对5637细胞的杀伤效率，发现具有VH-VL结构和CD28共刺激域的CIgG-28ζ CAR-T细胞展现出最强的杀伤能力（图b）。此外，CIgG-28ζ CAR-T细胞在与5637细胞共培养6天后，被视为被激活的细胞（CIgG-28ζ_Stim），并观察到这些细胞在与肿瘤细胞接触后表现出肿瘤特异性免疫反应，包括细胞增殖和表面激活标志物4-1BB的上调（图c-d）。同时，评估了未激活和激活的CAR-T细胞中不同T细胞亚群（包括Tn、Tcm、Tem和Teff）的比例（图e-f）。这些结果表明，SIA-CIgG CAR-T细胞能够特异性地识别并杀伤表达SIA-CIgG的肿瘤细胞，并且在接触肿瘤抗原后能够诱导肿瘤特异性免疫反应。
图4中的内容比较了SIA-CIgG CAR-T细胞和HER2 CAR-T细胞在针对肿瘤细胞的杀伤效果、持续性以及细胞因子分泌方面的表现。结果显示，SIA-CIgG CAR-T细胞对SIA-CIgG阳性的肿瘤细胞（A431和NCI-H520）表现出较低的细胞毒性，对非肿瘤细胞线HEK293几乎没有细胞毒性，即使在高效应细胞与靶细胞比例（E:T）下。相比之下，HER2 CAR-T细胞对所有靶细胞，包括正常组织来源的HEK293细胞，都表现出强大的细胞毒性。在重复的肿瘤抗原刺激下，HER2 CAR-T细胞显示出更强的激活和扩增潜力，但也因此经历了更快和更广泛的细胞死亡。而SIA-CIgG CAR-T细胞则表现出较低的耗竭率，显示出更好的持续性。此外，两种CAR-T细胞在以2:1的E:T比例共培养时，与未转导的T细胞相比，都能分泌更多的IL-2、IL-5、TNF-α、IFN-γ和IL-13，但HER2 CAR-T细胞产生的细胞因子数量大约是SIA-CIgG CAR-T细胞的十倍。这些结果表明，SIA-CIgG CAR-T细胞在特异性杀伤SIA-CIgG依赖的靶细胞、持续性以及细胞因子分泌方面与HER2 CAR-T细胞存在显著差异。
图5中的内容展示了在刺激条件下SIA-CIgG CAR-T细胞的转录组和染色质可及性的变化。通过对连续刺激14天的CAR-T细胞与未刺激的CAR-T细胞进行转录组分析和ATAC测序，发现刺激后的CAR-T细胞中免疫相关基因（如IL1A、CXCL13、TFEC、TNFRSF21和转录因子PPARG）的表达水平更高。Metascape富集分析显示，刺激后的CAR-T细胞激活了免疫相关信号通路和缺氧相关通路。T细胞功能基因集评分显示，刺激后的CAR-T细胞的细胞毒性和抑制性评分显著增加，而未激活评分显著降低。在免疫检查点的研究中，CD39、TIM-3、LAG-3和PD-1在刺激后的CAR-T细胞中显著上调。GSEA KEGG分析显示，刺激后的CAR-T细胞中细胞因子-受体相互作用的通路富集。ATAC测序结果表明，刺激后的CAR-T细胞的染色质可及性显著低于未刺激的CAR-T细胞。与RNA-seq结果一致，刺激后的CAR-T细胞中CXCL13、IL1A和PPARG的染色质可及性更高。这些结果表明，刺激后的CAR-T细胞与细胞对外信号的响应、增殖、分化以及细胞因子产生和免疫反应相关通路的激活有关。在启动子区域（<=1kb），刺激后的CAR-T细胞的染色质可及性显著低于未刺激的CAR-T细胞。这些发现揭示了CAR-T细胞在激活状态下的分子变化，这对于理解其抗肿瘤活性和功能特性至关重要。
图6中的内容展示了组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）伏立诺对SIA-CIgG CAR-T细胞杀伤效率的影响。研究发现，与CAR-T细胞单独治疗相比，伏立诺、nivolumab和everolimus三种药物与CAR-T细胞联合使用时，增强了对肿瘤细胞的杀伤效果。特别是伏立诺，它不仅增加了CAR-T细胞表面CAR表达的均值荧光强度（MFI），表明CAR表达上调，而且还显著上调了CD8+ CAR-T细胞中的4-1BB表达，并轻微降低了PD-1和LAG-3的表面表达。这些结果表明，伏立诺能够迅速且显著地增强CAR-T细胞的细胞毒性，并且可能使SIA-CIgG CAR-T细胞更加敏感。这些发现支持伏立诺作为一种潜在的增强SIA-CIgG CAR-T细胞疗效的药物。
图7中的内容展示了在NOD-SCID-Il2rg−/− (NSG)小鼠模型中，SIA-CIgG CAR-T细胞单独使用以及与伏立诺联合使用对膀胱癌（BC）的抗肿瘤效果。结果显示，接受未转导T细胞（Control-T）治疗的小鼠肿瘤呈现稳定且持续增长的趋势。相比之下，接受SIA-CIgG CAR-T细胞治疗的小鼠在CAR-T细胞注射后的第7、11、18和23天分别有一只小鼠实现了完全的肿瘤清除。而在SIA-CIgG CAR-T细胞和伏立诺联合治疗组中，观察到显著的肿瘤抑制效果，具体来说，有七只小鼠在CAR-T细胞治疗后的第11天实现了完全的肿瘤清除，另一只小鼠在第18天实现了完全的肿瘤清除。在所有实现完全肿瘤清除的小鼠中，没有观察到肿瘤复发的迹象。这些结果表明，SIA-CIgG CAR-T细胞和伏立诺的联合治疗在体内对BC具有显著的疗效。
作者团队在本文中主要研究了针对SIA-CIgG的CAR-T细胞疗法在膀胱癌治疗中的潜力。研究发现了SIA-CIgG在膀胱癌组织中会高度表达，而在正常组织中表达较低，这使其成为CAR-T细胞治疗的潜在靶点。通过构建不同结构的CAR-T细胞，评估了其对肿瘤细胞的杀伤效率，结果显示特定结构的SIA-CIgG CAR-T细胞具有较好的杀伤能力。与HER2 CAR-T细胞相比，SIA-CIgG CAR-T细胞展现出了更温和的细胞毒性和更好的持久性。通过RNA-seq和ATAC-seq分析，研究揭示了CAR-T细胞在多次肿瘤细胞挑战后的转录组和染色质可及性变化。在研究中，伏立诺被发现能增强SIA-CIgG CAR-T细胞的杀伤效率，其联合治疗在体内模型中显示出显著的抗肿瘤效果，证明了SIA-CIgG CAR-T细胞和伏立诺联合治疗膀胱癌的方案极具治疗潜力。
