主题 | 猕猴桃采后施用异常威克汉姆酵母后在贮藏过程中微生物群落的变化 | ||
| 题目 | Changes of the microbial community in kiwifruit during storage after postharvest application of Wickerhamomyces anomalus | ||
| 期刊 | Food Chemistry | ||
| 中科院 分区 | 1区 | 影响 因子 | 8.5 |
| 第一 作者 | Qianhua Zhao | 通讯 作者 | Hongyin Zhang |
| 单位 | School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, 301 Xuefu Road, Zhenjiang 212013, Jiangsu, China | ||
| 原文 链接 | https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.134593 | ||
高通量测序技术可以为了解外源微生物制剂与果实微生物群落之间的相互作用提供重要信息，并解释其如何控制采后真菌病害。在本研究中，我们发现异常威克汉姆酵母可以控制猕猴桃采后病害。同时，高通量测序技术结果表明，经过异常威克汉姆酵母处理后，真菌群落在微生物群落中的组成和结构变化明显大于细菌。异常威克汉姆酵母可以在果实内部定殖并调节细菌的群落组成，以减少病原体的丰度，最终维持果实的健康状态。应用异常威克汉姆酵母后，猕猴桃微生物群落中的优势属表现出相互作用能力的增强。一些真菌或细菌与附生和内生样品群落中的酵母呈正相关，指导猕猴桃采后病害复合生物防治菌株的合成。
猕猴桃富含维生素C和多种氨基酸，营养价值很高。其风味独特，深受消费者喜爱。遗憾的是，猕猴桃在贮藏和销售过程中会发生采后病害，造成严重的经济损失。特别是由扩展青霉、灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌、链格孢菌和间座壳属真菌等引起的感染，是猕猴桃最严重的采后病害。由于公众对健康和环境原因的需求，继续推动安全有效的合成杀菌剂替代品的开发。采后作物病害的微生物拮抗剂已应用于猕猴桃保鲜。
我们发现异常威克汉姆酵母显著降低了扩展青霉和灰葡萄孢菌引起的腐烂发生率，并减缓了猕猴桃品质的恶化。然而，异常威克汉姆酵母对猕猴桃采后病害的生物防治机制尚不清楚。因此，本研究采用高通量测序技术分析异常威克汉姆酵母对采后猕猴桃附生和内生微生物群落结构的影响。进一步阐明了异常威克汉姆酵母控制猕猴桃采后病害的机制与微生物群落变化之间的关系。此外，通过建立微生物属之间的相关性，筛选出猕猴桃潜在的有益菌株，为进一步开发有效控制猕猴桃采后病害的辅助菌株提供了概念基础。
3.1 异常威克汉姆酵母对猕猴桃采后病害的生防效果
经无菌水处理4天后，猕猴桃腐烂率达到100%。拮抗酵母菌可降低猕猴桃腐烂病的发生率，其防治效果与浓度有关（图1A）。酵母浓度为1×107、1×108、1×109 cells/mL处理的猕猴桃腐烂发生率显著降低，青霉病和灰霉病的发病率分别可控制在3.3%和35.53%。酵母菌处理果实的病斑直径显著（p<0.05）低于对照果实（图1B）。在两个最高浓度（1×108和1×109 cells/mL）下，异常威克汉姆酵母处理降低幅度最大，且差异不显著。但1×109 cells/ mL的拮抗酵母浓度过高，可能导致果实中营养物质的过量消耗。我们为以下实验选择了1×108cells/mL的异常威克汉姆酵母浓度。
图1 不同浓度的异常威克汉姆酵母对扩展青霉和灰葡萄孢菌引起猕猴桃腐烂的影响。在 20°C、相对湿度 85-90% 条件下保存 4 天后测量发病率 (A) 和病斑直径 (B)
3.2 贮藏期间异常威克汉姆酵母对猕猴桃自然发病率及品质指标的影响
异常威克汉姆酵母处理对猕猴桃自然发病率及主要品质指标的影响见表1。可以看出，异常威克汉姆酵母处理显著降低了猕猴桃的自然发病率、失重和硬度，有效控制了采后软化和腐烂的发生率。采后猕猴桃贮藏过程中可滴定酸、可溶性固形物和抗坏血酸含量的降低是影响猕猴桃品质的主要因素。异常威克汉姆酵母处理减轻了可滴定酸、可溶性固形物和VC含量的降低。因此，异常威克汉姆酵母处理可能有助于保持猕猴桃的品质。
表1 异常威克汉姆酵母对猕猴桃贮藏 14 天期间自然腐烂和品质的影响
3.3.1 附生微生物群落
采用香农指数来反映群落的丰富度和均匀度。酵母处理组真菌群落香农指数显著低于对照组，且第0天和第8天差异极显著（p<0.01）（图2A）。
对于细菌群落（图2B），酵母处理组和对照组在储存期间的香农指数先增加后减少。在第0、4、8和12天，对照组的香农指数显著高于酵母处理组。
3.3.2 内生微生物群落
内生样品真菌群落之间的α多样性差异测试如图2C所示。酵母处理组和对照组的香农指数在第0天没有差异，而在其他天有显著差异。在第4天和第12天，酵母处理组的香农指数显著高于对照组。第12天两组间差异极显著（p<0.01）。
第0天和第12天，对照组和酵母处理组内生细菌群落的香农指数没有显著差异（图2D）。第4天，对照组香农指数显著高于治疗组（p<0.05）。第8天，酵母处理组显著高于对照组（p<0.05）。
图2 箱线图显示了猕猴桃样品中附生（真菌 A、细菌 B）和内生（真菌 C、细菌 D）群落的香农指数（epi：附生样品，endo：内生样品，CK：对照，Y：异常威克汉姆酵母处理，数字代表储存天数）
3.4.1 附生微生物群落
基于Bray-Curtis差值的PCoA分析，对群落的β多样性进行了分析，将酵母处理的果实表面真菌群落分别与对照组进行聚类分析。两者之间距离相对较远（图S1A）。异常威克汉姆酵母的添加显著地改变了附生真菌群落。
对于细菌（图S1B）来说，epi_Y0样品远离其他样品，表明它们具有不同的群落结构。对照组之间的距离较近，说明对照组的群落在贮藏过程中没有发生显著变化。
3.4.2 内生微生物群落
根据内生样品PCoA图中真菌群落的分布显示，酵母处理组较为接近（图S1C），而4个对照组较为分散。Endo_CK0、endo_CK4和endo_CK12与其他组相差甚远。这表明内生对照组的真菌群落不稳定。
对于细菌群落（图S1D），酵母处理组的样品在第4、8和12天更接近，而对照组的样品在第8和12天更接近。在第0天时，两组样品与其他样品相差甚远。
3.5.1 附生微生物群落
我们将所有样本中平均相对丰度<1%的其他类别进行分类。如图3A所示，附生真菌群落被注释为八个属。对照组中Cladosporium所占比例最高，其次是Sarocladium。在酵母处理组中，异常威克汉姆酵母在0-12天的平均相对丰度超过60%，其中第8天的丰度最高（81.31%）。对贮藏期间对照组和酵母处理组的优势属进行了分析（图4A）。结果发现，异常威克汉姆酵母的相对丰度显著高于对照组（p<0.01），而在0-12天期间，对照组的Cladosporium、Sarocladium、Vishniacozyma和Plectosphaerella的相对丰度显著高于酵母处理组（p<0.01）。
在附生样品的细菌群落中鉴定出16个属（图3B），其中Pseudomonas、Sphingomonas和Methylobacterium的相对丰度排名靠前。选择处理组和对照组之间具有显著差异的6个属进行图谱分析（图4A）。贮藏期间对照组Sphingomonas和Methylobacterium的相对丰度高于酵母处理组。除第8天外，对照组Actinomycetospora的丰度均显著高于试验组（p<0.01）。两组中Massilia和Pseudomonas的变化相似。在第0天，酵母处理组的相对丰度高于对照组，并在第4天和第8天出现波动。到了第12天，酵母处理组再次高于对照组。在第12天，酵母处理组中Stenotrophomonas的丰度显著高于对照组（p<0.01）。
图3 猕猴桃样品附生（真菌A、细菌B）和内生（真菌C、细菌D）群落组成
3.5.2 内生微生物群落
在内生样品的真菌群落中鉴定出11个属（图3C）。对照组和酵母处理组同时发现异常威克汉姆酵母，且后者所占比例较高，在第4、8、12d显著高于对照组。异常威克汉姆酵母的丰度先增加后减少。病原真菌是内生菌群落中的优势属，包括Cladosporium，Alternaria，Diaporthe，Botryosphaeria，Penicillium和 Botrytis等，可引起猕猴桃病害。我们选择了几个属进行差异分析（图4B）。除第8天外，酵母处理组中的Cladosporium均显著高于对照组。第0天时Alternaria的相对丰度为31.01%，随后随时间推移而降低。Diaporthe的相对丰度在第4天达到最高相对丰度，为55.4%。在第12天时对照组的Botryosphaeria相对丰度为55.72%，显著高于酵母处理组（p<0.01）。
在内生样品的细菌群落中鉴定出15个属（见图3D），其中Pseudomonas、Acinetobacter和Stenotrophomonas在所有属中相对丰度较高。酵母处理组和对照组之间存在不同的优势属（图4B）。贮藏过程中酵母处理组的Lelliottia相对丰度高于对照组，并且在第4天和第8天存在显著差异（p<0.05）。在第8天，酵母处理组中的Stenotrophomonas的相对丰度显著高于对照组（p<0.05）。同时，在第12天，酵母处理组中的Brevundimonas的相对丰度显著高于对照组（p<0.01）。
图4 几个属的猕猴桃附生（A）和内生（B）样品（CK：对照，Y：W. anomalus处理）在贮藏期间的变化曲线
3.6.1 附生微生物群落
为了计算属之间的相关性，我们选择了有效的关系对并绘制了相关网络图。对照组附生样品的网络图中共有23个节点和34条边，节点中包括7种真菌和16种细菌（图5A）。边的颜色表示相关性，红线代表正相关，蓝线代表负相关。Bulleromyces与Wickerhamomyces直接相关。Vishniacozyma、Novosphingobium、Stenotrophomonas、Sphingomonas、Massilla、AllorhizobiumNeorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium与Wickerhamomyces间接相关。Goluberia和Tilletiopsis与Cladosporium和Sarocladium呈负相关。Sphingomonas、Geodermatophilus、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium具有较多的相关边。根据计算出的模块度显示节点颜色；对照组有五个模块。Bulleromyces、Vishniacozyma、Novosphingobium、Stenoopticomonas与Wickerhamomyces属于同一模块。
酵母处理组比对照组有更多的边。在酵母处理组的属级相关网络图中总共观察到24个节点和52条边（图5B）。发现Plectosphaerella和Wickerhamomyces之间存在负相关关系。Methylobacterium, Geodermatophilus与Pseudonocardia呈负相关。Actinomycetospora、Methylobacterium、Novosphingobium与Pseudomonas拥有有更多的边。
根据网络属性的统计计算（表S1），与对照组相比，酵母处理的附生样品的平均度、平均加权度、图距离、平均网络距离和图密度较高，相关网络图的模块度较低。
3.6.2 内生微生物群落
在对照组内生微生物群落相关网络图中，14个节点之间存在13条边关系（图5C）。Golubevia与异常威克汉姆酵母直接正相关，且多种病原菌之间也存在正相关。边数较多的病原菌为青霉属、泥霉属、鞘氨醇属、麦芽属、肉芽孢属和链格孢属Penicillium、Diaporthe、Sphingobium、Lelliottia、Sarocladium和Alternaria。一个模块中存在三种病原菌：葡萄胞（Botrytis）、枝孢菌属（Cladosporium）和帚枝霉属（Sarocladium），并且它们呈正相关。Golubevia和Nitrosssomonas与Wickerhamomyces位于同一模块中。在酵母处理组的网络图中，12个节点有15条边（图5D），我们发现Wickerhamomyces和Pseudomonas、Lelliotta之间存在正相关关系。边数排名靠前的属是Wickerhamomyces、Penicillium、Sphingobium、Lelliottia、Pseudomonas和Sphingomonas。在表S1的网络属性计算中，与附生结果相似，经过酵母处理的内生样本的平均度、平均加权度、平均聚类系数和图密度均高于对照组。
图5 基于属水平大于 1% 的平均相对丰度，对附生 (CK: A, Y: B) 和内生 (CK: A, Y: B) 群落组成进行网络分析
异常威克汉姆酵母能有效防治猕猴桃采后病害。本研究发现，异常威克汉姆酵母在果实表面具有良好的定殖能力，在果实内部也能增殖。异常威克汉姆酵母降低了病原真菌的丰度并调节了细菌群落的组成，以维持猕猴桃的采后品质。通过高通量测序分析，可以表明异常威克汉姆酵母对猕猴桃附生和内生群落的组织产生积极影响，并对真菌群落产生显著影响。需要进一步阐明异常威克汉姆酵母对一些间接相关属的影响，以确定它们对猕猴桃健康的重要性。这项研究处于生物防治发展策略的前沿，并考虑了微生物组在以可持续方式控制病原体中的重要性。最终，这些结果将有助于更好地理解微生物拮抗剂控制采后果实病害的机制，并为构建有益微生物合成菌群以提高猕猴桃采后安全性提供思路。
本文图表均来自本文献
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文献解读：杨梦含
编辑：杨梦含
校稿：赵沁雨
审核：马婷婷
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