128 红肉猕猴桃酒中羰基化合物的探索及非挥发性有机酸之间的感知相互作用

红肉奇异果酒风味的感官知觉是香气、味道和口感综合作用的结果，所有这些都取决于不同风味活性化合物的浓度。目前利用单一的仪器设置对挥发性和非挥发性风味活性化合物进行高通量定量的简化方法已成为研究热点。化学衍生化具有增强风味化合物的电离效率和色谱分离的潜力，从而在液相色谱—质谱法（LC-MS）中提升检测灵敏度并拓宽风味化合物覆盖范围。流动相的复杂组成和离子强度是电喷雾条件下的关键影响因素，影响整个电喷雾过程中液滴和离子的产生。含有羰基的风味化合物（有机酸、醛和酮）在食品领域中发挥着多方面的关键作用。在食品基质中羰基化合物的定量领域，已采用了3-NPH（3-硝基苯肼）。然而，缺乏比较和表征3-NPH衍生的羰基化合物的不同流动相组成的全面探索。

通常使用剂量超过阈值 （DOT） 方法评估羰基化合物对酒精饮料的味道影响。DOT因子是通过将化合物的浓度除以其相应的味道阈值得出的。当风味化合物的浓度低于各自的阈值时，它们在整个基质中对整体感官特征的影响通常被认为是最小的。因此，表现出DOT值≥1的风味化合物值得通过重组和遗漏实验进一步探索，以阐明其感官效应。然而，某些研究表明，即使在低于阈值水平下，特定化合物也可能通过协同相互作用对感官知觉产生显着影响。因此，在评估羰基化合物对葡萄酒感官属性的贡献时，必须承认完全依赖DOT方法所带来的潜在偏差。

该研究旨在通过利用UPLC-MS/MS来简化红肉猕猴桃酒中羰基化合物的复杂分析，包括制定一种新的UPLC-MS/MS方法，该方法采用3-NPH衍生化来精确定量羰基化合物，并深入探索非挥发性有机酸之间可以想象的感知相互作用。

为开发红肉猕猴桃酒中羰基化合物的高通量联合定量分析方法，采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术，对红肉猕猴桃酒中的非挥发性有机酸、挥发性有机酸、醛酮等进行了分析。

为了提高MS/MS检测灵敏度，在直接注入MS离子源之前，对含有上述羰基化合物的标准溶液进行衍生化。此外，通过调查流动相组成对MS信号灵敏度的影响，对羰基化合物UPLC-MS/MS分析中使用的七种不同的二元流动相系统进行了比较评估。挥发性有机酸、非挥发性有机酸、醛类和酮类分别选择乙酸、乳酸、糠醛和2,3-丁二酮作为代表化合物。根据峰面积选择流动相。

图2显示了七种洗脱液的效果。四种代表性羰基化合物的强度随着流动相中乙酸铵和甲酸比例的增加而增加，并且当同时加入5 mM乙酸铵和0.1%(v/v)甲酸的水和乙腈溶液时达到最高强度。该研究认为与甲酸溶液相比，醋酸铵电喷雾是ESI阴性模式下检测灵敏度提高的原因。此外，在羰基化合物UPLC-MS/MS分析中应避免高甲酸浓度，因为这会导致MS信号的灵敏度降低。使用高甲酸浓度时MS信号灵敏度降低的机制尚不清楚。然而甲酸的存在可能会导致氢受损，从而降低带电羰基化合物的MS信号。

在该研究的优化条件下，34种风味羰基化合物的典型色谱图如图3A所示。大多数峰显示环绕洗脱。根据极性和结构在色谱柱上分离分析物，而母离子和产物离子则通过MS/MS分离。图3B显示了柱分离过程中共洗脱的两种化合物（编号14和15）。这种峰重叠使得难以进行定性和定量分析。然而，化合物14和15很容易通过MS/MS分离，因为它们的母离子和产物离子之间的差异较大。UPLC使用直径小于2 Am的颗粒来实现出色的分离。例如，术前使用UPLC分离异构体（异丁酸和丁酸）（图3C）。使用柱色谱法和MS/MS依次分离化合物。因此，有效减少了共洗脱组分的干扰，并且在UPLC-MS/MS分析过程中可以检测到更多的峰。

使用不同的参数对精制技术进行了验证，包括线性、提取回收率、精密度和基质效应，如表1所示。进行方法验证是为了确定新优化的方法在红肉猕猴桃酒样品分析中实际应用的适用性和可靠性。通过检查一系列至少涵盖七个浓度水平的标准溶液来评估羰基化合物的线性，然后对这些数据集进行线性回归分析。这种良好的回归性能强调了该方法的可靠性和稳定性，所有目标化合物的高拟合值(R2)范围为0.9902至0.9997。本研究中获得的LOD和LOQ范围分别为0.07至4.80 μg/L和0.23至17.76 μg/L。

不同的分析方法使用不同的性能指标来测量酒精饮料中的羰基化合物。该方法建立的检测限与以前的文献相当，对于大多数化合物甚至更低。与早期的研究相比，该研究中检查的分析物范围显著扩大。以前的研究主要集中在挥发性或非挥发性羰基化合物的分析，而该研究偏离了这一惯例，涵盖了更广泛的光谱。具体而言，我们的分析包括4个不同类别的羰基化合物，共34个独特的实体，包括8个挥发性有机酸，16个非挥发性有机酸，6个挥发性醛和4个挥发性酮。

该方法能够测定红肉猕猴桃酒中的羰基化合物。挥发性有机酸的浓度范围为癸酸0.009 mg/L至乙酸218.61 mg/L。非挥发性有机酸的浓度在丁香酸0.001 mg/L和乳酸1920.39 mg/L之间。测定的醛类和酮类浓度分别为：3-戊烯-2-酮约0.009 mg/L，3-羟基-2-丁酮约75.08 mg/L。这些结果与之前报道的数据类似，显示柠檬酸、苹果酸和酒石酸是猕猴桃酒中的主要有机酸。

酚酸是具有苯环和羟基的有机化合物，具有抗氧化和抗炎等生物活性。该研究首次对猕猴桃酒中的香草酸、丁香酸和3,4-二羟基苯甲酸进行了定量。OAV和DOT通常用于确定风味化合物的贡献度。乙酸（DOT为1.8）和乳酸（DOT为1.4）可能对红肉猕猴桃酒的酸味有显著影响。OAV>1的两种风味化合物是香草醛和2,3-丁二酮。在红肉猕猴桃酒，乳酸和醋酸的DOT值>1。相比之下，柠檬酸、苹果酸和酒石酸的DOT为˂1(0.3–0.6)。

进行三角测试来仔细检查阈下有机酸和阈上有机酸之间的味觉相互作用，在不同的实验配置中采用三种替代方法。测试反应构成了后续统计评估的基础。主要的三角测量试验（表2，测试1-5）集中于单个非挥发性有机酸。在辨别阈值(DOT)˂1为特征的化合物中，酒石酸、苹果酸和柠檬酸的影响在单组分添加测试中无显著性差异。相反，相对于对照水样，两种DOT>1的非挥发性有机酸表现出显著差异。此外，添加两种超阈值非挥发性有机酸的组合效果显著。此外，随着三种阈下非挥发性有机酸的引入，越来越多的感官小组参与者检测到酸味感知的变化，导致显著性阈值从0.01 大幅降低至0.001（表2，测试7）。另外，感官评价显示在试验7中酸味强度显著增加。同时添加三种阈下有机酸比不添加乙酸和乳酸更显著（表2，试验6和7）。

研究人员将风味成分之间的关联分为四个不同的类别。为了证实这些成分的感官影响是否源自简单的添加现象或累积效应，评估了掺入三种阈下有机酸对两种阈上有机酸味觉的影响（图4A）。添加所述三种低于阈值的非挥发性有机酸后，两种超阈值非挥发性有机酸的阈值降低了2.8倍(图4B-2C)。该结果表明，三种低于阈值非挥发性有机酸可能对低于阈值浓度下的整体风味有贡献。

随后，Feller的加性模型被用来对非挥发性有机酸内的味道相互作用进行更全面的探索。感官测试的结果表明，在混合物中检测到酸味感觉的观察概率超出了计算的预期。酸味感知的估计阈值确定为1.96 mL，与计算的味觉阈值0.99 mL相比减少了2.0倍（图 4D）。