122 两个NAC转录因子在猕猴桃成熟过程中通过激活木葡聚糖内转葡萄糖酶/水解酶基因调控果实软化

果实软化是多种细胞过程的结果，包括细胞壁成分和结构的变化。木葡聚糖内转葡萄糖酶/水解酶(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase, XTH)是木葡聚糖代谢和细胞壁松动的关键参与者，为其他细胞壁代谢相关酶的进一步修饰做准备。许多转录因子(transcription factors, TFs)已被鉴定并发现作为细胞壁代谢相关酶基因的激活或抑制因子，从而促进或抑制果实软化。近年来研究发现NAC TFs对果实成熟和软化有调节作用，但NAC TFs是否与猕猴桃软化有关仍然是未知的。猕猴桃作为一种更年期水果，采收后容易发生成熟和软化，从而影响贮藏寿命。了解猕猴桃成熟过程中的分子生物学调控机制，有助于延长猕猴桃的贮藏时间。本研究从猕猴桃中分离出两个NAC TFs和两个XTH基因，分析其生物信息学和基因表达模式，并探究AcNAC1和AcNAC2蛋白的转录激活活性。同时，研究在猕猴桃成熟过程中，AcNAC1和AcNAC2调控AcXTH1和AcXTH2对果实软化的影响。

1.AcNAC1和AcNAC2的序列分析

在RNA-seq数据库中，两个NAC基因(AcNAC1、AcNAC2)，在猕猴桃成熟过程中表达水平升高。如图1A所示，系统发育树显示AcNAC1和AcNAC2与参与果实衰老和成熟的AtNAP、CpNAC1和CpNAC3都属于NAP亚家族，因此AcNAC1和AcNAC2可能在猕猴桃成熟过程中发挥作用。此外，将AcNAC1和AcNAC2与其他NAC tf进行对比，发现它们都包含NAC保守结构域(A-E子结构域)(图1B)。结果表明，AcNAC1和AcNAC2都是NAP亚家族的NAC TFs，可能在猕猴桃成熟过程中发挥作用。

如图1C、1D所示，AcNAC1和AcNAC2既不含信号肽也无跨膜结构，说明它们不属于膜蛋白和分泌蛋白。由图1E可知，AcNAC1和AcNAC2均含有亲水性和疏水性氨基酸，且两种蛋白中亲水性氨基酸含量较高，证明了AcNAC1和AcNAC2属于亲水性蛋白。通过三维结构建模发现，AcNAC1和AcNAC2的结构具有显著的相似性(图1G)。

图1 猕猴桃AcNAC1和AcNAC2的生物信息学分析。(A) AcNAC1、AcNAC2和其他NAC TFs的系统发育关系。(B) AcNAC1和AcNAC2与其他NAC蛋白的多重比对。黑线A到E对应NAC保守域。NLS用蓝线标出。(C) AcNAC1和AcNAC2信号肽预测。(D)猕猴桃AcNAC1和AcNAC2蛋白跨膜结构预测。(E) AcNAC1和AcNAC2蛋白的亲水性分析。(F) AcNAC1和AcNAC2蛋白二级结构预测。(G)猕猴桃AcNAC1和AcNAC2蛋白三级结构模型预测。

2.AcXTH1和AcXTH2的序列分析

在RNA-seq数据库中，AcXTH1和AcXTH2两个XTH基因的表达水平在猕猴桃成熟过程中呈上升趋势。AcXTH1和AcXTH2与其他XTH蛋白比对显示，它们都含有催化位点，表明AcXTH1和AcXTH2具有木葡聚糖内转葡萄糖酶/水解酶的催化活性。如图2D所示，AcXTH1具有跨膜结构，而AcXTH2不具有跨膜结构。由图2E可知，AcXTH1和AcXTH2均含有亲水性和疏水性氨基酸，且两种蛋白中亲水性氨基酸含量较高，证实了AcXTH1和AcXTH2属于亲水性蛋白。通过三维结构建模发现，AcXTH1和AcXTH2的结构具有显著的相似性(图2G)。

图2 猕猴桃AcXTH1和AcXTH2的生物信息学分析。(A) AcXTH1、AcXTH2与其他XTHs的系统发育关系。(B) AcXTH1、AcXTH2与其他XTHs的多次比对。红框为催化位点，两个半胱氨酸用*标记。(C) AcXTH1和AcXTH2信号肽预测。(D)猕猴桃AcXTH1和AcXTH2蛋白跨膜结构预测。(E) AcXTH1和AcXTH2的亲水性分析。(F) AcXTH1和AcXTH2蛋白二级结构预测。(G)猕猴桃AcXTH1和AcXTH2蛋白三级结构模型预测。

3.AcNAC1和AcNAC2的亚细胞定位

AcNAC1和AcNAC2都包含核定位序列(NLS)(图1B)，预示着它们可能是核蛋白。如图3所示，来自AcNAC1和AcNAC2的绿色荧光信号在细胞核中发现，而GFP空对照分布在整个细胞中。以上结果提示AcNAC1和AcNAC2为核蛋白，可能在细胞核中发挥作用。

图3 烟草AcNAC1和AcNAC2的亚细胞定位。

4.AcNACs和AcXTHs的表达

AcNAC1、AcNAC2、AcXTH1和AcXTH2在猕猴桃贮藏过程中呈升高趋势(图4)，与果实硬度下降趋势呈密切负相关(图5)。总的来说，果实软化是由细胞壁代谢相关酶基因在转录水平上的表达决定的。从RT-qPCR数据和猕猴桃成熟过程中的硬度可以看出，AcXTH1和AcXTH2可能在转录水平上调控果实软化。与AcXTH1和AcXTH2类似，AcNAC1和AcNAC2的转录水平也大幅升高(图4)，且与贮藏过程中果实硬度呈负相关(图5)。综上所述，木葡聚糖内转糖基化酶/水解酶基因(AcXTH1和AcXTH2)和NAC TF基因(AcNAC1和AcNAC2)的高表达水平可能与猕猴桃成熟过程中果实软化有关。

图4 猕猴桃成熟过程中AcNAC1、AcNAC2、AcXTH1和AcXTH2表达水平的变化。

图5 硬度与AcNAC1、AcNAC2、AcXTH1、AcXTH2之间的Pearson相关分析热图。积极的影响用红色表示，消极的影响用蓝色表示。

5.相关分析

对猕猴桃硬度与AcNAC1、AcNAC2、AcXTH1和AcXTH2进行了相关分析。如图5所示，相关分析显示，硬度与AcNAC1、AcNAC2、AcXTH1、AcXTH2呈负相关。AcNAC1、AcNAC2与AcXTH1、AcXTH2均呈正相关。结果表明，猕猴桃软化与木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因和NAC转录调控因子密切相关。

6.AcNAC1和AcNAC2与AcXTH1和AcXTH2的启动子结合

基于AcNACs和AcXTHs的表达模式(图4)以及果实硬度、AcNACs和AcXTHs的相关性分析(图5)，AcNAC1和AcNAC2可能是AcXTHs调控的可能候选基因。在AcXTH1的启动子(-53至-4)中出现了两个NACBSs，在AcXTH2的启动子(-90至-41)中发现了两个NACBSs，这表明AcNAC1和AcNAC2可能是AcXTH1和AcXTH2的调节因子。

为了测试AcNAC1和AcNAC2是否能结合AcXTH1和AcXTH2的启动子，本研究进行了电泳迁移率移动测定(EMSA)。如图6所示，AcNAC1和AcNAC2蛋白都可以与AcXTH1和AcXTH2启动子结合，并且可以通过添加大量未标记探针来消除其结合能力。上述结果表明，AcNAC1和AcNAC2在体外特异性结合AcXTH1和AcXTH2启动子中的NACBS基序。

图6 AcNAC1和AcNAC2与AcXTH1和AcXTH2的启动子结合。+和-分别代表存在和不存在。++或++表示为竞争添加大量未标记探针。

7.AcNAC1和AcNAC2的转录活性

采用DLR法检测AcNAC1和AcNAC2的转录活性。与pBD空对照相比，pBD- acnac1、pBD- acnac2和pBD- vp16(阳性对照)显著激活了LUC的表达，证明AcNAC1和AcNAC2都是转录激活因子。

图7 烟草AcNAC1和AcNAC2的转录活性。(A) DLR实验报告基因和效应基因示意图。(B)利用农杆菌将报告菌和效应菌共同转化到烟叶中。2 d后，测定LUC/REN的比值。pBD的LUC/REN值设为1。

8.AcNAC1和AcNAC2在体内激活AcXTH1和AcXTH2启动子

图8 瞬时表达实验显示AcNAC1和AcNAC2激活了AcXTH1或AcXTH2的启动子活性。(A)检测中使用的报告基因(CaMV35S-REN/AcXTH1 pro-LUC和CaMV35S-REN/AcXTH2 pro-LUC)和效应基因(CaMV35S-AcNAC1和CaMV35S-AcNAC2)的示意图。(B) AcNAC1和AcNAC2激活了AcXTH1或AcXTH2的启动子活性。