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| 主题 | 两种乙烯响应转录因子 AdVAL2 和 AdKAN2 调节猕猴桃淀粉降解的早期步骤 | ||
| 题目 | Two ethylene-responsive transcription factors, AdVAL2 and AdKAN2, regulate early steps in kiwifruit starch degradation | ||
| 期刊 | Postharvest Biology and Technology | ||
| 中科院分区 | 1区 | 影响因子 | 6.4 |
| 第一作者 | Yang Tong | 通讯作者 | Xue ren Yin、Xiang Li |
| 单位 | College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Zijingang Campus, Hangzhou, Zhejiang 310058, PR China | ||
| 原文链接 | https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2024.113058 | ||
研究背景
目前关于果实成熟的潜在调控机制已被广泛研究，由于物种特异性差异，不同水果的相同生理性状由不同的基因决定。因此有必要探索和研究不同水果中的成熟调控基因。多年生果树的幼期很长，这意味着转基因和突变研究不容易在多年生果实上进行。目前已经使用了不同的方法通过各种处理（例如温度，植物激素）来了解果实成熟。乙烯在调节果实成熟中起着重要作用，因此对其潜在机制进行了深入研究。在各种水果品种中，乙烯（ETH）处理后对果实生理生化状态有显著影响。大部分研究一直集中在乙烯处理后时期，针对早期反应基因调节因子的研究较少。
猕猴桃是一种对乙烯敏感的呼吸跃变型水果，在收获后成熟时会产生大量的内源乙烯。猕猴桃的成熟过程伴随着生理变化，如淀粉降解、可溶性固体的积累、细胞壁代谢引起的质地变化和香气的产生。先前的研究揭示了大量与猕猴桃成熟相关的基因，乙烯合成相关的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（AdACO1）敲除可以延迟果实软化。木聚糖酶内切葡聚糖酶/水解酶（XTH）基因在细胞壁的分解中起作用。AdBAM3L/3.1/9（β-淀粉酶）、AdAMY1（α-淀粉酶）和AdAGL3（α-葡萄糖苷酶）与淀粉降解有关。这些编码生物合成酶和TF的基因大多基于乙烯处理后材料进行表征，而非常早期的乙烯响应调节因子仍未表征。
研究内容
该研究为探究早期乙烯反应机制，采用乙烯处理下2 h取样间隔的连续取样方法。测定了乙烯处理下24 h内果实的淀粉含量和总可溶性固形物（TSS）变化，进一步利用转录组、双荧光素酶、电泳迁移率检测（EMSA）和瞬时过表达确定导致猕猴桃淀粉降解的新型TFs，为乙烯驱动猕猴桃成熟软化的分子机制提供了见解。
研究结果
ETH处理加速了果实成熟过程，导致淀粉降解和TSS积累。ETH处理的淀粉降解始于处理 12 HIT（hour in treatment）。然而，与CK相比，ETH在 18-24 HIT时淀粉降解显著。ETH的淀粉含量从0 HIT时的 59.7 g·kg-1降至 24 HIT 时的 44.1 g·kg-1，而对照果实的淀粉含量在24 HIT时降至56.3 g kg-1（图1A）。TSS含量呈相反趋势，ETH的TSS含量增加（从0 HIT时的5.2%增加到24 HIT时 7.6%），而CK的TSS含量保持不变，从5.2%增加到24h时的5.4% (图1B)。
收集0-24 HIT乙烯处理和空气控制样品39个，构建39个文库（CK 0 h、2 h、6 h、10 h、14 h、18 h和24 h; ETH 2 h、6 h、10 h、14 h、18 h和 24 h）并测序。PCA分析和FPKM的初步聚类显示ETH处理对基因表达有明显影响。
在转录组中发现52个与淀粉降解相关的基因。其中，BAM基因表达的增加与淀粉降解显著相关（图2A）。三个BAM基因的转录本（AdBAM3， Acc16695; AdBAM3.1，Acc15874; AdBAM3L，Acc28966）在BAM家族成员中含量最高（图2A）。此外，通过RT-qPCR验证了这三个BAM基因的表达（图2B）。
在排除具有FPKM<5或错误发现率为>0.01的基因后，将12,490个基因置于WGCNA中，以筛选三个BAM基因的候选TF（图3A）。所有基因均基于相关聚类分析进行分析（图3B）。相应的相关性导致基因被分为24个模块。对于每个BAM，筛选出具有最高或最低比相关系数的模块（图3C）。共观察到50个TF在两个处理中差异表达（图4）。其中，3个BAM基因分别预测了23个、18个、22个TFs。
为了进一步确定TFs与淀粉降解酶编码基因之间的关系，采用双荧光素酶实验进行启动子活性检测。在对AdBAM3和AdBAM3L启动子进行检测时，只有少数 TFs表现出明显的活性（图5A），其中AdVAL2（Acc16580）和AdKAN2（Acc29456）分别对AdBAM3和AdBAM3L的启动子显示出超过2倍的强诱导抑制作用。RT-qPCR分析表明，这两种TF对乙烯的反应都很早（AdKAN2为2 HIT；AdVAL2为6 HIT），乙烯处理会抑制其表达（图5B）。
亚细胞定位结果表明，AdVALZ和AdKAN2都位于细胞核中（图6A）。EMSA检测显示AdVAL2和AdKAN2分别对来自AdBAM3启动子的探针4和来自AdBAM3L启动子的探针1具有亲和力。用冷探针进一步分析显示这些TF与启动子之间的特异性结合（图6B）。这些结果表明，AdVAL2和AdKAN2可以物理结合BAM基因启动子上的顺式元件，并且这两种TF在细胞核中表达，从而具有在体内与启动子结合的条件。
根据双荧光素酶和EMSA检测的结果，发现AdVAL2和AdBAM3以及AdKAN2和AdBAM3L之间存在调控关系。此外，AdVAL2和AdKAN2似乎对乙烯处理有反应。此外，还进行了瞬时过表达实验，以证实猕猴桃中TFs对其靶基因的体内调控（图7A）。RT-qPCR结果显示，过表达端AdVAL2的表达量是对照端的1.54倍。瞬时过表达AdVAL2能显著抑制AdBAM3的表达，使其表达量减少了1.67倍。同样，过表达端AdKAN2的表达量增加到对照端的2.37倍，导致AdBAM3L的表达量减少了2.78倍（图7B）。此外，过表达果实的淀粉含量也较高。与空载体相比，AdKAN2过表达核心组织中的淀粉含量增加到1.26倍，在AdVAN2过表达的核心组织中增加到1.3倍（图7C）。
研究结论
该研究发现，乙烯处理10 h后淀粉降解和TSS积累加速。基于RNA-seq和实时荧光定量PCR数据，3个β-淀粉酶基因AdBAM3、AdBAM3.1和AdBAM3L在乙烯处理样品中显著上调。加权基因共表达网络分析（WGCNA）根据基因表达模式鉴定了与这三个BAM基因高度相关的TF。AdVAL2（一种含 B3 结构域的转录因子）和AdKAN2（一种含 MYB 的结构域转录因子）分别在转录上抑制AdBAM3和AdBAM3L的启动子活性。此外，AdVAL2和AdKAN2的表达均被乙烯处理抑制。瞬时过表达分析证实了AdVAL2和AdKAN2对BAM基因表达的抑制作用，导致猕猴桃淀粉积累。总而言之，在乙烯暴露期间的连续取样表明，这些早期的乙烯反应TF可能是淀粉降解的潜在触发因素。
本文图表均来自本文献
文献解读：赵沁雨
编辑：赵沁雨
校稿：赵沁雨
审核：马婷婷
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