134 转录组分析揭示臭氧处理通过调节植物激素信号通路维持鲜切猕猴桃中抗坏血酸含量

猕猴桃以其独特的抗坏血酸(Ascorbic acid, AsA)含量而著称。AsA在维持采后果实的生理和代谢稳态方面起着至关重要的作用，是评估猕猴桃质量的主要标准，其水平在未成熟的绿色阶段达到峰值，并随着果实衰老或对外部压力的反应而下降。

由于机械损伤和储存条件，鲜切猕猴桃容易受到氧化应激的影响，产生各种活性氧(reactive oxygen species, ROS)。AsA作为一种小分子抗氧化剂，可以与自由基和过氧化氢相互作用，作为对抗ROS的主要防御机制。从理论上讲，高度氧化的臭氧分子会消耗更多的AsA，导致ROS的积累。然而有研究表明，臭氧可以有效地触发抗氧化系统，抑制储存期间ROS的积累，有助于抵抗氧化损伤。臭氧处理可能通过影响某些特定代谢途径，增强抗氧化酶活性和抗氧化水平，减弱AsA的损失。

植物激素作为复杂信号网络中的调节分子参与调节过程，在调节植物生长、发育和代谢过程中起着至关重要的作用。该网络对各种非生物胁迫做出反应，包括臭氧、盐和寒冷胁迫。初步实验表明，臭氧处理对内源性植物激素水平的影响程度不同。植物激素信号转导途径的激活是由臭氧自动分解过程中产生的ROS启动的。这个过程也导致生理代谢不可避免地发生变化。由于AsA及其代谢物和相关基因是猕猴桃生理和抗氧化系统的一部分，因此探索臭氧处理后鲜切猕猴桃在贮藏过程中是否能受到内源性植物激素的调节至关重要。

为了验证上述假设，本文评估了与鲜切猕猴桃代谢相关的各种理化指标，利用转录组学分析探索调节抗坏血酸代谢和植物激素信号转导的复杂网络，鉴定必需基因，并分析其顺式作用元件。因此，本研究旨在阐明臭氧处理对鲜切猕猴桃AsA水平影响的调控机制，为利用臭氧处理保存富含AsA的鲜切水果和蔬菜提供了理论基础。

1.TSS、TA含量和TSS/TA

在鲜切猕猴桃储存过程中，两组的TSS水平均升高。其中臭氧处理组的TSS的积累速率降低(图1A)。TA含量的变化反映了TSS的变化(图1B)。图1C表示，对照组的TSS/TA值显著增加，臭氧处理组增加较慢。

2.AsA、DHA含量和AsA/DHA比

在贮藏期间，两组的AsA含量均有所下降(图2A)。此外，臭氧处理组的猕猴桃前2 d的AsA含量显著高于对照组。然而，在储存期结束之前，两组之间没有观察到显着差异。在对照组中，DHA含量显着增加，在第8天达到峰值，比臭氧处理组高1.46倍，随后下降(图2B)。臭氧处理植物的DHA含量也遵循类似的趋势，但在整个储存期间仍低于对照组。AsA/DHA比率的变化表现出与DHA相反的模式(图2C)。在两个样本的8天储存期内，比率均有所下降。然而，经臭氧处理的样品始终保持在较高水平。

3.转录组分析

通过转录组学分析，进一步阐明臭氧处理对鲜切猕猴桃贮藏过程中AsA代谢的分子机制。从样本中总共获得了5.4821亿个raw reads和5.1548亿个clean reads。此外，至少 94.23% 的clean reads达到了Q30分数(错误概率为 0.1%)，96.56 %–97.41% 的clean reads被唯一地映射到猕猴桃基因组。图3A和3B表明，CK0与CK6和O₃0与O₃6的比较中，样品的三个重复之间存在良好的相关性(相关系数>0.72)。这一发现表明，过滤后的数据具有很高的可靠性，确保其适用于进一步分析。贮存6 d后，CK0与CK6和O₃0与O₃6组中分别发现了7,132个DEGs (3,727个上调和3,405个下调)和8,077个DEGs (4,227个上调和3,850个下调)(图3 C)。

4.GO富集分析和KEGG通路富集分析

DEGs的GO富集分析分为三类：生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)。图3D和3E展示了CK0与CK6和O₃0与O₃6的比较中的前10个DEGs显著富集。分析显示，两组中参与代谢过程、膜和催化活性相关的在所有三个类别中都是最丰富的。此外，经臭氧处理后，BP类别在“对压力的反应”方面表现出更高的代表性。因此，可以假设底物参与由酶的催化功能介导的代谢调节。这些过程共同在保持鲜切猕猴桃在储存过程中的质量方面发挥着重要作用，主要作用于细胞膜。

进行KEGG通路分析以确定与DEG相关的生化通路。图3F和3G描述了以P<0.05为阈值的所得结果。代谢类别CK0与CK6和O₃0与O₃6表现出一定程度的富集程度，如“糖酵解/糖异生”、“苯丙烷生物合成”和“淀粉和蔗糖代谢”。此外，“植物-病原体相互作用”和“MAPK信号通路-植物”等通路在两组中均显著富集。与AsA合成、降解和循环相关的“抗坏血酸和醛酸代谢”通路在两组中都表现出显著富集。这些通路包括13个上调基因和12个下调基因。值得注意的是，在臭氧处理下，“植物激素信号转导”途径在储存6天后表现出最多的DEGs，具体包括116个DEGs (83个上调和33个下调)，但在贮藏过程中，基于CK0 和CK6的比较，其变化不显著。因此，臭氧处理可能通过影响储存过程中的“植物激素信号转导”途径来保持AsA含量。

5.抗坏血酸代谢中涉及的DEGs分析

本研究在两组的转录组中鉴定了25个与AsA代谢相关的DEGs。其中包括3种D-半乳糖醛酸还原酶(GalUR)、5种L-抗坏血酸过氧化物酶(APX)、3种UDP-葡萄糖醛酸 4-差向异构酶 (GAE)、2种UDP-葡萄糖6-脱氢酶(UGDH)、2种L-半乳糖1-磷酸磷酸酶(GPP)、2种 Monodehydro抗坏血酸还原酶(MDHAR)和两种GDP-D-甘露糖3′、5′差向异构酶(GME)。其中，3个APX(Actinidia03760、Actinidia37285和Actinidia00816)、2个GAE(Actinidia14461、Actinidia12251)基因、1个GPP基因(Actinidia39274)、1个UGDH基因(Actinidia04840)和所有GalUR基因在储存后均上调。所有MDHAR和GME基因都经历了下调。此外，在CK0与CK6的比较中，40% 的醛脱氢酶(ALDH)基因和一个GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GGP)基因下调，而O₃0与O₃6中ALDH基因表达的抑制率为50%。这些DEGs主要与L-半乳糖、D-半乳糖醛酸和抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)回收途径有关（图4）。鲜切猕猴桃在贮藏过程中通过促进其合成和激活AsA-GSH循环来调节AsA的动态，以保留营养并提高臭氧处理后的抗氧化能力。

6.与抗坏血酸代谢相关的DEGs的顺式元素分析

对AsA代谢调控的深入研究涉及顺式作用元件的预测。通过使用更大的FPKM (每千碱基长度的基因的百万分之一的片段数)的额外选择阈值来选择主要基因，提高了严格性。最终选择了6个与AsA代谢相关的候选基因：GME (Actinidia04499)、GPP (Actinidia11890)、GAE (Actinidia21259)、GalUR (Actinidia37489)、APX (Actinidia03760)和MDHAR (Actinidia36095)。图4显示启动子区域含有多种激素反应元件，主要是20个ABA反应元件(ABRE)。此外，6个基因包含18个MeJA反应元件(TGACG基序和CGTCA基序)。Actinidia03760因其广泛的激素反应性和最多的顺式作用元件而脱颖而出，包括7个ABRE (ABA)、1个TGA元件(生长素)、1个P-box (GA)、3个CGTCA基序(MeJA)、3个TGACG基序(MeJA)和1个TCA元件(SA)响应元件。此外，还鉴定出许多应力响应元件，其中光响应元件的数量和种类最多，包括GT1基序、G-box、Box 4、MRE和TCT基序。

7.植物激素信号转导中涉及的DEGs分析

在O₃0与O₃6 比较，在储存过程中鉴定出116个DEGs (图 5)。具体而言，在生长素信号通路中，除4个生长素反应因子(ARF)基因、2个生长素反应蛋白(AUX/IAA)基因和3个SAUR家族蛋白(SAUR)基因外，所有基因均上调。在细胞因子通路中，编码B-ARR蛋白的DEGs最丰富。此外，在O₃0与O₃6 比较中，GA信号通路中的所有DEGs (Actinidia09390除外)均上调。ABA信号转导通路为24 DEGs;1个吡咯烷蛋白抗性/PYR 样(PYR/PYL) 基因、所有蛋白磷酸酶2C (PP2C)基因和3个ABA反应性元件结合因子(ABF)基因水平下调，而10个PYR/PRL基因、2个ABF基因和所有蔗糖非发酵1相关蛋白激酶2 (SnRK2)基因均显著上调。在乙烯通路中，仅乙烯不敏感蛋白2 (EIN2)基因的表达下调，乙烯反应性转录因子1 (ERF1)基因的变化最显著。在芸苔素类固醇通路中，1个Brassinooid耐药1/2 (BZR1/2)基因、1个木葡聚糖：木葡糖基转移酶(TCH4)和1个细胞周期蛋白D3 (CYCD3)基因的水平下调。茉莉酸通路表现出9个DEGs，包括茉莉酸抗性1 (JAR1)和茉莉酸ZIM结构域(JAZ)基因。水杨酸途径包括编码TGACG结合因子(TGA)和发病相关蛋白1 (PR-1)的8个DEGs。臭氧处理后，所有17个基因的水平在储存过程中上调不同。这些发现共同表明，臭氧处理显著影响植物激素信号转导途径，从而改变了鲜切猕猴桃在贮藏过程中的生理和理化特性。

8.内源性植物激素含量

植物激素含量呈显著变化(图6)。臭氧处理在储存期的大部分时间里持续降低生长素、CTK、GA和ACC水平，与调节细胞分裂和果实成熟有关。其中，两组ACC含量呈现出分化趋势。相反，臭氧处理组的ABA、BR、JA和SA浓度高于对照组。

9.差异表达的转录因子对臭氧的响应

为了确定内源性激素是否影响臭氧对AsA代谢，我们分析了从“植物激素信号转导”途径预测的转录因子(TFs)。如图7A所示，116个DEG中有26个被标记为TFs，属于8个科，其中数量最多的是bZIP (7)，其次是GRAS (5)和ERF (4)。不同TFs和DEGs与AsA代谢的相关性表明，bHLH TFs与AsA代谢无关(图7B)。然而，bZIP TFs与大多数DEGs显著相关，其中Actinidia03760被认为是第6节中的关键候选基因，也与bZIP TFs显著相关。

10.使用qRT-PCR分析转录组数据可靠性

通过qRT-PCR检测15种随机选择的与代谢途径、信号转导和抗氧化活性相关的DEGs的表达水平。这些结果与基于RNA-seq观察到的模式非常吻合(图8A-O)。此外，线性回归分析表明，通过qRT-PCR测量的DEGs表达模式与RNA-seq结果呈正相关(R2= 0.90056) (图 8P)，证实了转录组数据稳定可靠。

11.实测指标之间的相关性分析

为了更好地了解臭氧处理鲜切猕猴桃AsA变化的内因，对量化生理和关键转录组数据进行了Pearson的相关性分析。图9显示AsA含量与ABA、ACC和SA水平呈显著正相关。相反，AsA含量与BR、CTK、Auxin和GA含量呈负相关。ABA和SA的强相关系数分别为 r = 0.88 和 r = 0.81。这一发现与AsA相关的DEG中存在许多激素反应元件相一致。此外，AsA与TA含量呈正相关，与TSS含量呈负相关。与AsA代谢相关的GalUR和APX与其他酶的相关性模式相反。

本研究证实，臭氧处理对鲜切猕猴桃营养品质的有效性受植物激素信号通路的调控，其中ABA和SA对AsA含量的维持有显著贡献。臭氧处理还延缓了衰老，导致TSS/TA降低，AsA/DHA比率升高。Actinidia03760作为一种有前途的候选靶基因，可用于阐明转录因子(如 bZIP)参与调节AsA代谢的机制。综上所述，本研究为利用臭氧控制AsA代谢提供了依据，为臭氧在AsA含量高的产品中的应用提供了理论依据。