074 猕猴桃MYBS1和GBF3转录因子通过激活半乳糖磷酸化酶相关基因的转录来影响L-抗坏血酸的生物合成

在植物中，L-抗坏血酸（维生素C）是一种主要的抗氧化剂，在光合作用、呼吸作用、细胞分裂、生长调节、整合植物激素信号和衰老中起作用。AsA（抗坏血酸）是人类无法自行合成的必需微量营养素，必须从饮食中获取，主要来源于水果和蔬菜。摄入维生素C带来许多的健康益处，例如降低中风的风险、支持免疫系统、支持心血管健康和减少皮肤老化。考虑到AsA在人类健康中的重要作用，研究聚焦在一些高AsA含量果实（AsA含量约为500-3000 mg·100g^-1 FW）中AsA积累的分子机制，可以帮助育种者在将来增加作物植物的AsA含量。毛花猕猴桃（Actinidia eriantha），具有高AsA含量特征，高AsA性状已经被报道定位到第26号染色体上。

在植物中，AsA的积累通过合成、降解和再循环以及细胞内和细胞间的运输来维持体内平衡。L-半乳糖途径是AsA在高等植物中积累的主要途径，参与该途径的所有基因都已被表征，该途径中的限制步骤是D-mannose-1-P向L-galactose-1-P的转化，由酶GMP、GME和GGP连续催化。越来越多的证据表明：GGP是调节植物中AsA生物合成的关键途径。GGP基因的过表达导致AsA在各种植物中显著增加。例如，通过在番茄中过表达GGP，AsA增加了6倍。

转录因子（transcription factors，TFs）通过识别特定的顺式作用元件并与靶基因的启动子结合来调控基因的表达，从而调节植物的发育和生理过程。到目前为止，已经报道了许多TFs参与AsA的生物合成，包括AP2 ethylene response factors ERF98和ABI 4（仅在根中表达）、AMR 1、the basic helic-loop-helix bHLH59、HD-Zip家族SlHZ 24，然而，这些因子作用不同，对AsA含量的影响相对较小。

1.鉴定猕猴桃中影响维生素C合成的关键基因与相关转录因子

2.揭示转录因子协同调控基因促进猕猴桃维生素C合成的分子机制

3.为高维生素C果蔬育种创新提供新的科学依据

图2 （a-b）以6个猴桃为样品，将空载（EV）、AceGGP3过表达载体（OX-AceGGP3）、AceGGP3反义表达载体（TRV-AceGGP3）瞬时转化侵染猕猴桃果实，7天后测量AceGGP3的表达量（a）和AsA含量（b）。（c-d）在野生型WT，以及过表达AceGGP3的5个株系中AceGGP3的表达量（c）以及AsA含量（d）。（e）AceGGP3外显子区域的sgRNA示意图。（f）AceGGP3基因的CRISPR/Cas9载体和靶位点选择示意图。（g）基因特异性引物扩增的胶图。（h）T1代AceGGP3纯合突变株的测序结果和色谱图。（i）CRISPR/cas9诱导的AceGGP3突变体中愈伤组织的相对AsA含量。

2. AceMYBS1是AceGGP3的转录激活因子 

研究者通过转录组分析发现一个转录因子Actinidia31027，其表达与猕猴桃Actinidia32270 （GGP3）表达高度相关，qRT-PCR分析也显示其表达与A.eriantha中AceGGP3表达和AsA含量高度相关。由Actinidia31027和其他植物物种 MYBs的氨基酸序列组成的系统发育树表明，Actinidia31027与雷公藤（Tripterygium wilfordii）的TwMYBS1关系最密切，氨基酸序列同一性达到了86%，而与柑橘（Citrus clementina）中的CcMYB5相差最远。因此，将这种蛋白质命名为 AceMYBS1。

为了揭示AceMYBS1调控AceGGP3的机制，研究者首先进行了酵母单杂交实验（Y1H）。所有酵母细胞在SD/-Trp/-Ura培养基上生长良好，而只有阳性对照、以及诱饵载体（bait vector）AceGGP3pro::LacZ与目标载体（prey vector）pJG-AceMYBS1共转化至酵母中时，会在补充有X-gal的培养基上形成蓝色细胞，显示AceMYBS1促进由AceGGP3启动子驱动的LacZ表达（图 3a，b）。在验证相互作用的双荧光素酶测定分析试验中，AceMYBS1和AceGGP3启动子共转染的烟草也比对照具有更高得多的相对LUC/REN比率。

研究者利用JASPAR 2020预测了MYBS1的顺式作用元件。在所有预测的MYBS1顺式元件中，AceGGP3的启动子内鉴定出2个主要的顺式元件（分别在-2455bp，TCTTATC；-1534bp，TCTTATC）。从A.eriantha中扩增了4个5′-truncated AceGGP3启动子，命名为P₁₁₀₆，P₁₆₀₆，P₂₀₈₈和P₂₆₆₀。通过双荧光素酶报告系统验证了转录活性（图3c，d），P₁₆₀₆和P₂₆₆₀的活性高于P₁₁₀₆和P₂₀₈₈，表明顺式元件可能位于-1106-1606bp和-2088-2660bp之间，与预测位置的区间相同。为了验证AceMYBS1与这些基序的结合特异性，研究者进行了电泳迁移率分析（EMSAs，electrophoretic mobility shift assay），发现AceMYBS1-His融合蛋白可以结合含有该基序的DNA探针，而非标记的竞争探针以剂量依赖的方式有效地降低了AceMYBS1的结合能力，使核心序列的突变消除了结合（图3e）。这些结果表明，AceMYBS1直接与AceGGP3启动子结合，并作为AceGGP3的转录激活因子。

图3 （a）酵母单杂实验质粒示意图。（b）酵母单杂实验显示AceMYBS1和AceGGP3启动子（AceGGP3pro：：Lacz）相互作用。（c）报告质粒和效应质粒的示意图。（d）本氏烟草叶片双荧光素酶（LUC）实验结果。（e）电泳迁移率试验（EMSA）显示AceMYBS1与AceGGP3启动子结合。

为了探究A.eriantha中AceMYBS1的表达谱，研究者采用qRT-PCR技术检测了果实中转录本的积累情况。与AsA含量一致，AceMYBS1在果实发育早期高表达，并与AceGGP3的表达呈正相关。A.eriantha果实的瞬时表达实验（图4a-d）证实，过表达AceMYBS1使AceGGP3的表达量增加了1.4倍（图4b，c），导致果实中AsA含量增加了1.7倍（图4d）。相比之下，在AceMYBS1抑制果实（Anti-AceMYBS1）的果实中AceGGP3的表达量下降了30%（图4b，c）。与果实一样，在A.eriantha猕猴桃愈伤组织中过表达AceMYBS1可使AceGGP3的表达量增加1.8倍，AsA含量增加2.36倍，而与空载体感染的愈伤组织相比，侵染Anti-AceMYBS1的愈伤组织AceGGP3的表达量和AsA含量显著降低（图4e-g）。当AceGGP3被Anti-AceGGP3抑制时，即使在A.eriantha愈伤组织和转基因品系中过表达AceMYBS1，AsA含量也没有增加（图4f，g），说明AceMYBS1是AceGGP3的上游调控因子。为了进一步了解AceMYBS1的调控作用，研究者获得了6个稳定过表达的转基因猕猴桃株系（图4h-k）。qRT-PCR证实，这6个独立的转基因株中AceMYBS1表达水平提高（图4i），进而使AceGGP3的表达量增加2.5-4倍（图4j）。AsA含量分别比对照组增加1.4倍、1.6倍、2.0倍、1.5倍、1.7倍和1.8倍（图4k）。

研究者利用CRISPR/Cas9系统，进一步突变了A.eriantha的AceMYBS1（图4l-p）。靶点位于第一和第三外显子内（图4l-m）。总共得到5个独立的AceMYBS1突变体（mybs1#12，1bp缺失；mybs1#28，26bp的缺失；mybs1#30，3-bp缺失；mybs1#41，1bp插入；mybs1#53，4bp的缺失）（图4o）。AceMYBS1编辑株系的AsA含量分别下降了33.2%、23.1%、9.8%、40.4%和40.0%（图4p）。综上所述，这些发现支持AceMYBS1是一个调节AsA合成的积极因素。

图4 （a-d）花后80天的A.eriantha树上果实进行了瞬时表达实验。转染7天后瞬时表达AceMYBS1的猕猴桃果实中AceMYBS1（b）和AceGGP3（c）的qRT-PCR分析和AsA含量（d）。（e-g）愈伤组织瞬时表达实验结果。（h-k）组织培养野生型（WT）和6个过表达AceMYBS1的转基因猕猴桃株系。（l）AceMYBS1基因sgRNA靶点图。（m）CRISPR/Cas9载体示意图。（n）WT和5个AceMYBS1突变株的表型。（o）来自T1代的AceMYBS1纯合突变体系的测序结果和色谱图。（p）AceMYBS1编辑的猕猴桃愈伤组织的相对AsA含量。

3. AceGBF3与AceMYBS1共同作用，上调 AceGGP3的表达并增加猕猴桃中AsA的合成

为了进一步研究AceMYBS1的功能，研究者通过酵母双杂筛选试验（Y2H）来筛选鉴定与AceMYBS1相互作用的蛋白，共筛选出85个酵母转化子，鉴定出8个阳性克隆含有与其全长序列相同的cDNA。该序列编码一个bZIP蛋白（Actinidia27344），该蛋白的表达也与AceGGP3的表达相关，根据生物信息学分析，将该蛋白命名为AceGBF3（图5a，b）。进一步的结构域分析显示，AceGBF3的N端（AceGBF3- N，amino acids 1-151）而不是C端（AceGBF3-C，amino acids 152-300）与AceMYBS1相互作用。另外还进行了转录活性测定，用BD-AceMYBS1或BD-AceGBF3而不是pGBKT7空载体转化的酵母细胞正常生长，并在SD/-T/-H/-A/+X-α-Gal培养基上变成蓝色。

为了进一步探究AceGBF3和AceMYBS1蛋白之间的潜在相互作用，研究者采用了3种不同的方法。首先，选择BiFC实验（双分子荧光互补技术)作为使用细胞生物学方法进行体内试验的方法。将AceMYBS1和AceGBF3蛋白分别融合到YFP（一种荧光蛋白）的c端（AceMYBS1-cyfp）和YFP的n端（AceGBF3-nYFP），然后瞬间转化到洋葱表皮细胞。定位于细胞核的YFP信号显示AceMYBS1和AceGBF3之间有密切的相互作用和核定位（图5c）。其次，使用荧光素酶互补实验证实这种相互作用，将AceMYBS1融合到LUC的c端一半（AceMYBS1- cluc），将AceGBF3融合到LUC的n端一半（AceGBF3-nluc），并在本氏烟草叶片中瞬时表达。只有与AceMYBS1-CLUC和AceGBF3的物理相互作用通过重组纯化蛋白的体外pull-down试验被证实。使用GST树脂时，AceGBF3-GST融合蛋白与AceMYBS1-6×His沉淀，而单独与6×His一起时不沉淀（图5e）。

图5 （a）酵母双杂质粒图谱。（b）转化酵母细胞在SD/-Trp/-Leu（-T-L）和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/+X-a-gal（-T-L-h-a+X-a-gal）培养基上生长，空白pGADT7（AD）作为阴性对照。（c）在洋葱表皮细胞中进行AceMYBS1和AceGBF3相互作用的双分子荧光互补（BiFC）分析。（d）烟草叶片上进行双分子发光互补实验（BiLC）实验。（e）体外 pull-down试验。

为了验证AceGBF3和AceMYBS1共同调控AsA合成的假设，研究者进行了双荧光素酶试验（Dual-LUC）、过表达和病毒诱导基因沉默实验。这些试验表明，AceMYBS1和AceMYBS1+AceGBF3而并非单独的 AceGBF3能提高AceGGP3的表达（分别增加了3.74倍和6.67倍）（图6a）。在不同的植物材料中，如猕猴桃（图6b-d）、愈伤组织（图6e-g）和烟草叶片中，瞬时过表达AceGBF3能够持续促进AsA的积累（图6b-g）。此外，AceGBF3与AceMYBS1共同过表达加大促进AsA的积累（图6h-k）。当AceMYBS1在A.eriantha果实中沉默后，无论AceGBF3是过表达还是抑制，AceGGP3的表达量和AsA的含量均显著降低或保持不变，证实了AceGBF3必须与AceMYBS1相互作用才能上调AceGGP3的转录（图6h-k）。此外，研究者还获得了5个过表达AceGBF3的A.eriantha转基因株系（图6l），AceGGP3转录水平（图6m）和AsA含量分别提高了2.11-3.38倍和1.22-1.78倍（图6n），与之前的结果一致。AceGBF3和AceMYBS1共表达系的转基因愈伤组织平均AsA含量（比WT愈伤组织高2倍）显著高于单独表达AceGBF3（1.4倍）和AceMYBS1（1.6倍）的愈伤组织（图6o-r）。上述结果表明，AceGBF3与AceMYBS1相互作用，共同调控AceGGP3的表达，形成一个参与猕猴桃AsA合成和代谢的AceGBF3-AceMYBS1-AceGGP3调控网络。

图6 （a）在本氏烟草上进行双荧光素酶实验。（b-c）在Actinidia eriantha果实转染后7天的qRT-PCR分析（d）在（b）实验中AsA的含量。（e-g）A.eriantha瞬时表达的愈伤组织中AceGBF3（e）和AceGGP3（f）以及AsA的相对含量（g）。（h）瞬时共表达AceMYBS1和AceGBF3的A.eriantha果实中AsA含量。（i-k）在（h）试验中qRT-PCR分析AceMYBS1（i）、AceGBF3（j）和AceGGP3（k）的表达。（l-m）转基因A.eriantha愈伤组织AceGBF3（l）和AceGGP3（m）qRT-PCR分析。（n）过表达AceGBF3的转基因愈伤组织AsA的相对含量。（o）AceMYBS1和AceGBF3单独和共表达转基因A. eriantha 愈伤组织中AsA的相对含量。（p-r）qRT-PCR分析AceGGP3（p）、AceGBF3（q）和AceMYBS1（r）在转基因猕猴桃愈伤组织中的表达情况。

4. ABA(脱落酸)通过AceMYBS1抑制AceGBF3-AceMYBS1-AceGGP3介导的AsA合成网络调控

已有研究证明了ABA在AsA的生物合成中发挥作用。为了确定ABA对AceGBF3-AceMYBS1-AceGGP3调控网络的影响，研究者用ABA（0、1、2、3、5和10µM）处理愈伤组织，结果表明，ABA抑制AsA的合成，尤其是在浓度为2µM时。研究者采用双荧光素酶法Dual-LUC检测ABA如何影响AceMYBS1和AceGBF3的相互作用。考虑到AceMYBS1和AceGBF3是与AceGGP3启动子共存，当 AceMYBS1与AceGGP3启动子-LUC共表达时，LUC/REN比值高于对照，而添加2 µM ABA后LUC/REN比值急剧下降（图7a）。与这些结果一致的是，在双分子荧光互补实验中活化的AceMYBS1-CLUC和AceGBF3-NLUC的荧光强度，在ABA作用下显著降低（图7b）。

为了确定哪些转录因子受ABA影响，研究者对藤上的A.eriantha果实喷施了20 µM的ABA，结果表明，ABA对AsA的合成有抑制作用，尤其是在处理后的第3天和第10天（图7c）。qRT-PCR分析显示，ABA处理抑制了AceMYBS1的表达，而不是AceGBF3的表达（图7d，e）。此外，对A.eriantha果实体外喷施ABA（图f-h），与之前的结果一致， ABA抑制了AsA的合成和AceMYBS1的表达，而AceGBF3的表达变化不大（图7f-h）。用ABA处理的AceMYBS1过表达株系中，AsA浓度和AceGGP3的表达量降低（图7i，j），而ABA处理过的mybs1基因编辑株中，AsA含量没有变化（图7k）。特别是，如果AceMYBS1 TF发生突变，AceGGP3的表达不受ABA的影响（图7l）。上述结果在A.eriantha愈伤组织的瞬时实验中得到证实，只要沉默AceMYBS1，ABA处理后AsA含量没有显著变化。这些数据说明ABA主要通过抑制AceMYBS1的表达来抑制AsA的合成。

图7 （a）本氏烟叶片双荧光素酶（LUC）实验。（b）使用AeGBF3-nLUC和AeMYBS1-cLUC构建的双分子发光互补（BiLC）实验。（c）20µM ABA处理的Actinidia eriantha果实AsA含量变化。（d-e）qRT-PCR分析（c）实验组果实的AceMYBS1（d）和AceGBF3（e）的表达。（f）在花后80天且在25℃下存储3天后，喷洒20µM ABA后分析AsA含量变化。（g-h）qRT-PCR分析（f）实验果中AceMYBS1（g）和AceGBF3（h）的表达。（i）2µM ABA处理AceMYBS1-过表达株后的AsA含量。（j）qRT-PCR分析（i）过表达株中的AceGGP3。（k）2µM ABA处理AceMYBS1突变株系后AsA相对含量。（l）qRT-PCR分析（k）实验中愈伤组织AceGGP3的表达。

本文探索总结了猕猴桃中抗坏血酸合成的AceGBF3-AceMYBS1-AceGGP3分子调控网络（图8），即AceMYBS1和AceGBF3是AsA含量的正调控因子，AceMYBS1直接结合AceGGP3启动子并激活其表达，AceGBF3和AceMYBS1相互作用可加性增加AceGGP3的表达和AsA的合成，而ABA主要通过抑制AceMYBS1的表达来抑制AsA的合成。

本文发现为未来猕猴桃等果蔬改良提供了科学依据，通过遗传手段提高猕猴桃商业栽培品种中维生素C的含量，是非常具有商业价值的，AeMYBS1和GBF3转录因子可能成为生物技术调控的潜在新工具，以提高植物对非生物胁迫的适应性。