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| 题目 | Lactiplantibacillus plantarum fermentation enhanced the protective effect of kiwifruit on intestinal injury in rats: Based on mitochondrial morphology and function | ||
| 期刊 | FOOD CHEMISTRY-X | ||
| 中科院分区 | 1区 | 影响 因子 | 6.1 |
| 第一作者 | Yun, Ma | 通讯 作者 | Zhou, Yan |
| 单位 | Guizhou Med Univ, Key Lab Environm Pollut Monitoring & Dis Control, Guiyang, Peoples R China | ||
| 原文链接 | https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2590157523004686?via%3Dihub#s0060 | ||
发酵食品对身体健康有保护作用。作者之前研究发现植物乳杆菌发酵增强了猕猴桃体外消化的抗氧化活性。在此基础上，本研究探讨了发酵猕猴桃对急性脂多糖(LPS)应激诱导的肠道损伤的保护作用。与未发酵猕猴桃果肉(KP)相比，植物乳杆菌发酵猕猴桃果肉(FKP-LP)的多肽、激素和维生素含量较高，而核酸和碳水化合物含量较低。FKP-LP可通过改善紧密连接形态和上调紧密连接蛋白mRNA表达来减轻肠道损伤。发酵猕猴桃通过AMPK及其下游因子PGC-1α、NRF1、NRF2、TFAM、ULK2等途径调节能量物质含量和呼吸链复合体酶活性，维持线粒体形态、线粒体呼吸功能和线粒体稳态，缓解LPS诱导的损伤。
发酵食品对人类健康有积极影响。最普遍的发酵产品是酸奶等乳制品。然而，水果和蔬菜等其他食物基质也被广泛研究。水果是乳酸发酵的极好基质。乳酸植物杆菌是最常用的水果和蔬菜发酵菌，其对促炎介质（IL-4，IL-6，IL-17a和TNFα）有抑制活性的作用。
猕猴桃是一种营养丰富的水果，含有高维生素C、膳食纤维、维生素E和叶酸，以及各种生物活性成分，有益于消化、免疫和代谢健康。在作者之前的研究中，发现与其他乳酸菌（如嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌）相比，具有更高的抗氧化性和体外活菌消化能力。线粒体是自由基作用的敏感部位，容易受到氧化损伤。近年来，维持线粒体功能被认为是减轻肠道损伤和促进肠道健康的关键。多酚可以促进线粒体生物生成，以确保肠道健康。植物乳杆菌发酵的猕猴桃是否能缓解肠道线粒体氧化损伤尚不清楚。
3.1 植物乳杆菌发酵对猕猴桃果肉成分的影响
为了探究生猕猴桃和发酵猕猴桃对肠道屏障功能的不同影响，首先分析了植物乳杆菌发酵后猕猴桃果肉成分的变化。与生猕猴桃浆相比，发酵猕猴桃浆具有更高的抗氧化能力。发酵后，总酚酸和总黄酮含量分别从116.49 mg/100 g、19.94 mg/100 g提高到157.00 mg/100 g、60.71 mg/100 g (p < 0.05)。与KP相比，FKP-LP样品对DPPH、ABTS、羟基和超氧阴离子自由基的清除能力分别提高了240.77%、20.83%、7.24%和15.41%(见补充表2)。
通过非靶向代谢组学检测小分子代谢物的变化。正离子和负离子模式下前20种代谢物的累积百分比如图1A和b所示。在正离子模式下，FKP-LP中d -三异柠檬酸、吲哚-3-丙烯酸、dl -色氨酸、2-羟基戊酸、2-羟基苯丙氨酸的含量较KP增加，α-乳糖、dl -精氨酸、Thr-Leu含量降低(图1A)。
如图1C所示，前20种代谢物共分为9类，与KP相比，FKP-LP中多肽、有机酸、维生素及辅助因子、类固醇、激素和递质含量增加，核酸和脂质含量减少。
阴性模式下，与生猕猴桃果肉、植物乳杆菌发酵猕猴桃果肉相比，柠檬酸、棕榈酸、蔗糖、α-海藻糖、DL-苹果酸、鸟苷、elaidi酸含量降低，D-(-)-青氨酸、DL-α-甲氧基苯乙酸、2-呋辛酸、2-氢己酸、柠檬酸含量升高(图1B)。这20种化合物被分为8类，通过发酵，脂质、多肽、维生素和辅助因子的含量增加，有机酸、碳水化合物、核酸的含量减少(图1D)。
采用PCA(主成分分析)和PLS-DA(偏最小二乘判别分析)分析两组间差异，建立猕猴桃果肉代谢组学模型。从正离子模式(图1E和F)和负离子模式(图1G和H)下的PCA评分和PLS-DA评分来看，图中两组明显分布在不同的区域，说明FKP-LP组和KP组的代谢物组成和结构存在较大差异。
随后，为了证明发酵对关键代谢物的影响，采用一维统计分析，按p值选择25种代谢物。在正离子模式下，发酵后的19个化合物增加，包括青蒿素、10-羟基癸酸、吡哆沙明、曲玉米素等，而6个代谢产物减少，如氢溴酸右美沙芬、坦那霉素、16-庚炔-1,2,4-三醇等(图2A)。阴性模型FKP-LP中18种代谢物增加，7种代谢物减少。
图1 猕猴桃果肉(KP)和植物乳杆菌发酵猕猴桃果肉(FKP-LP)成分的含量。(A)正离子模式下前20种代谢物的累积百分比直方图。(B)负离子模式下前20种代谢物的累积百分比直方图。(C)正离子模式下发挥生物学作用的代谢物积累百分比直方图。(D)负离子模式下发挥生物学作用的代谢物累积百分比直方图。(E)正离子模式下成分主成分分析(PCA)得分图。(F)负离子模式下成分PCA评分图。(G)正离子模式下组分PLS-DA(偏最小二乘判别分析)评分图。(H)负离子模式下组分PLS-DA评分图。
3.2 猕猴桃发酵果肉对肠粘膜机械屏障损伤的预防作用
研究了发酵猕猴桃果肉和猕猴桃果肉对肠道屏障功能的影响。测定血浆内毒素含量、DAO活性、紧密连接蛋白mRNA表达、肠及肠上皮细胞形态。血浆DAO活性升高被认为是肠屏障功能受损的标志(Zhang et al .， 2022)。对照组大鼠血浆DAO活性为4.77 U/L，急性LPS应激后升高至11.24 U/L (p < 0.05)， LPS组含量显著高于对照组，说明LPS应激导致血浆DAO含量升高(图3A)。而发酵猕猴桃果肉(FKP-LP)对LPS引起的血浆DAO含量升高有抑制作用。
分析肠紧密连接蛋白mRNA (claude -1、ZO-1和Occludin)表达情况，如图3B所示。LPS干预组Occludin mRNA水平显著低于对照组(p< 0.05)。而发酵猕猴桃果肉(FKP-LP)可抑制Occludin mRNA水平的下降。FKP-LP同样抑制了claude -1和ZO-1 mRNA水平的下降。
FKP-LP对结肠粘膜的表形影响如图3C所示。对照组结肠黏膜结构清晰，腺体排列有序。腹腔注射LPS的大鼠腺体紊乱，伴有大量炎症细胞浸润，而猕猴桃发酵浆(FKP-LP)改善了这种紊乱。同样，透射电镜下的结肠上皮细胞在10 K放大。对照组大鼠结肠上皮细胞间紧密连接结构清晰，可见明显的闭锁蛋白(图3D)。
与对照组相比，LPS组肠上皮细胞紧密连接模糊、疏松。而发酵猕猴桃果肉(FKP-LP)则改善了肠上皮细胞的紧密连接。
3.3 猕猴桃发酵果肉对结肠线粒体的抗氧化作用
在结肠线粒体中，LPS使MDA水平从39.60 nmol/mg prot升高到60.85 nmol/mg prot，而添加FKP-LP使MDA含量降低到46.73 nmol/mg prot (p < 0.05)(见表1)。与正常大鼠相比，LPS注射大鼠GSH-px、T-SOD和CAT活性分别降低了33.98%、25.00%和33.80%。发酵猕猴桃组GSH-px、T-SOD和CAT活性分别升高至142.57 U/mg prot、0.51 U/mg prot和30.44 U/mg prot，与LPS组相比差异显著(p < 0.05)，与正常大鼠相比差异不显著(p > 0.05)。
KP + LP组与LPS组GSH-Px、CAT活性及MDA含量无显著差异。由此可见，LP发酵猕猴桃对提高结肠线粒体抗氧化能力的作用更为显著。
表1 植物乳杆菌发酵猕猴桃对lps应激大鼠结肠抗氧化能力的影响。
3.4. 猕猴桃发酵果肉对肠道线粒体功能及呼吸链基因表达的影响
我们已经知道LPS注射诱导线粒体氧化，这些现象是通过FKP-LP而不是KP + LP来改善的。
线粒体是主要的能量提供者。首先采用高效液相色谱法检测ATP、ADP、AMP和总能量的含量，结果如图4A-D所示。LPS损伤后，ATP、ADP、AMP含量及总能量均较对照组升高(p < 0.05)。而FKP-LP组ATP、ADP、AMP含量和总能量分别降至52.59 ng/g、3.42 ng/g、329.43 ng/g和3.42 ng/g、384.85 ng/g，与LPS大鼠有显著差异(p< 0.05)，与正常大鼠无显著差异(p > 0.05)。KP + LP组仅ADP含量降至正常值，ATP、AMP、总能量含量与LPS组相比无显著差异。
ATP是通过线粒体呼吸链产生的，随后测定呼吸链复合体酶的活性。
从图4E-H可以看出，与对照组相比，LPS组MRCC III、MRCC IV和MRCC V增加，MRCC I明显减少(P < 0.05)。而KP + LP组和FKP-LP组MRCC III、MRCC IV和MRCC V活性的升高和MRCC I活性的下降均有所缓解。与LPS组相比，MRCC I活性提高至180.79 U/mg prot, MRCC III和MRCC V活性降低至0.64 U/mg prot和64.30 U/mg prot (p< 0.05)。
透射电镜观察肠上皮细胞线粒体的形态变化。对照组线粒体形态规整，嵴结构明显，表明线粒体形态完整(图4I)。LPS干预组线粒体外膜变形破裂。发酵猕猴桃果肉干预后，线粒体损伤均有不同程度缓解，且FKP-LP与LPS组相比线粒体结构更清晰，与对照组线粒体形态接近。
图4 猕猴桃发酵对肠道线粒体能量代谢ATP (A)、ADP (B)、AMP (C)和总能量(D)的影响，猕猴桃发酵对MRCC I (E)、MRCC III (F)、MRCC IV (G)和MRCC V (H)含量的影响，以及猕猴桃发酵对线粒体形态的影响。
3.5. 猕猴桃发酵果肉对线粒体稳态调节相关蛋白表达的影响
线粒体稳态是维持线粒体正常功能的关键。线粒体稳态受多种蛋白调控，如AMPK、PGC-1α等，分析AMPK、PGC-1α、NRF-1、NRF-2、TFAM和ULK-2的mRNA，结果如图5所示。
与对照组相比，LPS损伤诱导AMPK相对mRNA表达增加至1.774（p < 0.05）（图5 A），而KP+LP组（0.232）和FKP-LP组（0.336）的升高减轻，与LPS大鼠相比，与正常大鼠相比差异显著（p< 0.05）。
此外，LPS损伤诱导了PGC-1α、NRF-1、NRF-2、TFAM和ULK-2的mRNA表达增加，这些因素是AMPK的下游因子。LPS损伤后，PGC-1α、NRF-1、NRF-2、TFAM等与线粒体生物发生相关的相对mRNA表达显著升高。补充FKP-LP后，其死亡率分别为0.53、0.65、0.63和2.344，与LPS大鼠有显著差异。
ULK-2 与线粒体自噬有关。LPS损伤后ULK-2的相对mRNA表达显著升高至12.667，而补充KP+LP和FKP-LP后，ULK-2的相对mRNA表达显著增加至4.39和1.802，与LPS大鼠和正常大鼠相比差异显著。
图5 发酵猕猴桃果肉对肠道紧密连接蛋白基因AMPK (A)、PGC-1α (B)、NRF-1 (C)、NRF-2 (D)、TFAM (E)和ULK-2 (F)表达的影响。
综上所述，本研究证明，植物乳杆菌发酵可以提高猕猴桃的抗氧化能力，改变猕猴桃果肉的组成，发酵后的猕猴桃果肉可以缓解靶向线粒体的肠道LPS损伤。该机制可能有助于减少线粒体应激反应，线粒体应激反应受AMPK通路及其下游因子（包括PGC-1α、NRF-1、NRF-2、TFAM和ULK-2）调控。这些发现凸显了发酵猕猴桃果肉对肠道损伤的保护作用，为发酵食品对肠道健康提供了理论支持。
本文图表均来自本文献
文献解读：毛碧莹
编辑：毛碧莹
校稿：赵沁雨
审核：马婷婷
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