071 通过转录组分析赤霉素抑制猕猴桃采后成熟过程的机制

赤霉素(GAs)控制植物的许多过程，包括果实成熟。然而，气体在猕猴桃成熟过程中的作用还不清楚。在此研究中，我们发现GA₃处理延缓了猕猴桃果实的成熟过程，并检测了许多生理性状，如硬度、淀粉、总可溶性固体含量(TSS)、细胞壁成分(果胶、纤维素和半纤维素)、乙烯和酯的生成以及抗坏血酸(Vc)的浓度。转录组分析为研究猕猴桃果实成熟过程中GA₃的抑制机制和代谢变化提供了分子基础。共鉴定出3116个差异表达基因(DEGs)，其中51个基因涉及植物激素信号转导通路，36个基因与这些生理性状相关。采用实时荧光定量PCR技术对16个主要DEGs进行分析。GA₃处理显著抑制了2个乙烯生物合成基因(ACOs)、2个β-淀化酶(BAMs)、5个细胞壁修饰基因、1个GA2ox和1个GA受体GID1的表达，而增强了Actinidia29942(JAZ)的表达。多个生理指标与候选基因的相关性分析表明，GA₃能有效、全面地调控猕猴桃采后成熟。综上所述，这些GA响应基因可能在猕猴桃果实成熟过程中发挥重要作用，GA处理有望成为猕猴桃果实采后保存的一种有效方法。

采用0.3 g/L GA₃进行实验。红阳猕猴桃贮藏期间对照和GA₃处理的状态如图1A所示。在20℃贮藏过程中，无论处理与否，猕猴桃的硬度均不断下降，但GA₃处理猕猴桃的软化较对照缓慢。在28天的贮藏期内，对照和GA₃处理的果实硬度分别从84 N下降到3 N和16 N(图1B)。与硬度趋势相反，对照和GA₃处理的果实TSS分别从6%提高到15%和12%(图1C)。贮藏期间，对照果实的总酸下降，而GA₃处理的总酸则保持在一个相对稳定的水平(图1D)。GA₃处理的果实几乎不产生乙烯，而对照果实的乙烯产生在贮藏后期增加，并在28天达到最高水平(图1E)。此外，GA₃显著抑制了淀粉含量的下降趋势(图1F)。贮藏过程中，GA₃处理组的抗坏血酸含量虽略高于对照组，但两组间无显著差异(图1G)。

在本试验中，对照果实的细胞壁材料(CWM)从0天的80 g/kg迅速下降到14天的25 g/kg，并在28天持续下降到17 g/kg，而GA处理的果实在贮藏28天内下降速度明显减慢(图2)。CBP含量与CWM趋势一致。贮藏28天时，赤霉素处理猕猴桃和对照猕猴桃的CWM含量分别下降至31%和21%，纤维素含量下降至24%和6%，半纤维素含量下降至13%和8%，CBP含量下降至34%和12%(图2)。结果表明，GA₃处理显著延缓了果实的软化(淀粉和细胞壁的降解)，抑制了乙烯的产生和TSS的积累。但对抗坏血酸含量几乎没有影响(图1-2)。

图3A列出了五种主要的挥发物，包括醛、萜类、醇类、酯类和酮类。其中，酯类化合物在猕猴桃果实成熟过程中含量最多。GA₃处理组果实酯的含量从0天的71μg/kg增加到28天的143μg/kg，而对照果实酯含量在28天显著增加，达到7643μg/kg。与此相反，GA₃处理的总醛含量与酯含量呈现相反的趋势，从0天的1804μg/kg下降到28天时的951μg/kg，对照则为307μg/kg(图3A)。成熟猕猴桃中含量最丰富的酯类化合物是丁酸甲酯、丁酸乙酯、苯甲酸甲酯和己酸乙酯，它们的表达模式相似(图3B)。对于醛类，(E)−2-己烯醛和己醛是最丰富的化合物，它们在储存过程中普遍下降，特别是在对照组(图3C)。此外，在果实成熟过程中，酯的产生趋势与乙烯的产生趋势非常相似(图1E、图3B)。

本研究共鉴定出3116个DEGs，包括1299个下调的DEGs和1817个上调的DEGs(图4A)。这些DEGs的表达模式如图4B所示。这些DEGs被注释并分为生物过程、细胞成分和分子功能三类。代谢过程(GO:0008152)、细胞过程(GO:0009987)和催化活性(GO:0003824)是上调和下调的DEGs中最富集的三个项(图4C-D)。DEGs在植物激素信号转导(ko04075)、氨基糖和核苷酸糖代谢(ko00520)、淀粉和蔗糖代谢(ko00500)等代谢途径中富集(图4E)。其中植物激素信号转导途径最为丰富，共包含51个DEGs(其中下调16个，上调35个)(图4F)。Actinidia04459 (ETR)在对照果实中的表达量是GA₃处理果实的5倍(图4G)。说明GA₃处理对猕猴桃果实成熟过程中植物激素信号转导具有重要作用。从RNA-seq序列中共鉴定出36个目标基因，与对照相比，这些基因在GA处理后的果实中均表现出明显的抑制作用，包括3个乙烯生物合成基因、4个淀粉降解基因、8个香气合成基因、1个赤霉素合成相关基因，以及20个细胞壁降解基因(图5)。

实时荧光定量PCR结果表明，GA₃处理与对照的DEGs在猕猴桃贮藏过程中表达差异显著。除Actinidia19227和Actinidia29942外，其他基因的表达均受到GA₃的抑制(图6A-B)。在对照组猕猴桃中，Actinidia04459和Actinidia40067的表达量在7天后急剧增加，28天达到最大表达量，而GA₃处理组在较低水平上保持相对稳定，这与乙烯产生的表达模式一致(图1E，图6A-B)。猕猴桃Actinidia19372的表达在GA₃处理猕猴桃的贮藏过程中也保持在低水平，但在对照猕猴桃的14天后迅速增加，并在21天达到峰值(图6A)。然后，对RNA-seq与实时PCR进行相关分析，相关系数显著为0.95(图6C)，说明转录组数据具有较高的准确性。对于这些主要的DEGs，对照组中相对表达量最高的是Actinidia18484，其次是AcACO3、Actinidia11185和Actinidia01237(图6D)。在对照与GA₃的比较中，28 d变化最显著的基因是AcACO1、Acinidia39262和Actinidia11873(图6D)。

在生理性状上，TSS与硬度、淀粉、CWM、纤维素、半纤维素和CBP呈极显著的高度负相关。硬度、淀粉、CWM、纤维素、半纤维素与CBP呈极显著正相关。乙烯和酯之间也存在极显著的高度相关。在候选专业DEGs中，除AcEG1、Acβ-Gal3、AcEG1和JAZ，其他品种间均呈极显著的高正相关。在生理性状与基因的关系上，乙烯与AcACO1、AcACO3、BAM、AAT、ACPGC1、PME和ETR呈极显著的高度正相关。而总酸与AcBAM3L、BAM、AcPG1、GA2ox、ETR和GID1呈极显著正相关。

综上所述，本研究为GA₃延缓猕猴桃采后成熟软化的能力提供了充分的证据。生理特性结果表明，施用GA₃显著抑制了硬度、CWM和淀粉的含量，抑制了TSS、乙烯和酯的含量增加。转录组分析和实时荧光定量PCR结果显示，猕猴桃果实中存在16个主要的DEGs基因，它们与植物激素信号转导、乙烯合成、淀粉降解、细胞壁修饰和香气生成相关，可能是猕猴桃果实成熟和软化的关键候选基因。这些基因可能直接或间接响应GA₃的应用，进而调控果实成熟过程。