151 外源茉莉酸甲酯增强猕猴桃采后对灰霉菌抗性的分子和代谢机制

猕猴桃是一种广泛消费的水果，在世界范围内具有重要的经济和社会意义。然而，由灰霉菌感染引起的灰霉病是猕猴桃中的一种主要疾病，会导致采后变质。灰芽孢杆菌是菌核菌科的子囊菌，导致许多作物的果实出现灰霉菌。对猕猴桃灰霉病预防和控制的广泛研究主要集中在物理、化学和生物方法。这些研究为预防和控制猕猴桃灰霉病提供了宝贵的见解。

茉莉酸甲酯（MeJA）是一种内源性植物生长调节剂，是参与植物防御机制的关键信号分子，最终影响植物生长、发育和胁迫反应。MeJA是一种植物中天然存在的生长调节剂，已被确定通过刺激防御基因的表达、ROS代谢和苯丙烷类代谢来有效增强果实的抗病性。然而，有必要进一步研究MeJA治疗的分子机制。具体来说，可以采用代谢组学、转录组学和其他多组学联合方法来更全面地了解这些机制。

该研究中采用正交实验设计来确定诱导猕猴桃灰霉病抗性的最佳MeJA浓度和处理持续时间。评估了MeJA处理的猕猴桃中防御酶、植物激素和其他抗病相关物质的活性，并探讨了MeJA诱导猕猴桃抗病性的生理生化机制。通过转录组学和代谢组学分析相结合，旨在从生理、生化和分子水平系统鉴定MeJA诱导猕猴桃抗病的分子机制。

在这项研究中，确定不同浓度的MeJA会影响猕猴桃灰霉病的发生，揭示了对灰霉菌不同程度的抗性。MeJA浓度范围为0.001-1 mol/L，对猕猴桃伤口灰霉菌感染有不同程度的抑制作用。值得注意的是，在一定范围内较高的 MeJA浓度会导致更强的灰霉菌抗性（图1A）。具体而言，与5 dpi对照组相比，0.001-1 mol/L的MeJA浓度显著降低了疾病发生率和病灶面积。0.01 mol/L MeJA处理组的疾病发生率最低（减少 30%），病变面积最小（5 dpi时减少8.24 cm²）

广泛靶向的代谢组学分析在猕猴桃样品中共鉴定出 899种代谢物。随后，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）揭示了各种MeJA处理组之间的明显代谢物差异（图3A）。使用倍数变化评分≥ 1.2或≤ 0.8，结合VIP值1.5 ≥筛选DEMs。火山图分析表明，M_24_h 与 CK、M_72_h 与 CK 以及 M_24_h 与 M_72_h 之间分别有 64、62 和 63 种代谢物存在显著差异（图 3B）。相应的维恩图确定了M_24_h与CK和M_72_h与CK之间的14个共享DEM（图 3C）。

在M_24_h和CK之间的64个DEMs中，33个上调，31个下调。这些代谢物包括9种生物碱（isatidine, vomicine, vincamine, phyllalbine, piperidine, alexine, gramine, lumichrome, and trachelanthamidine）、7种类黄酮（dalbergioidin, L-epicatechin, epicatechin, procyanidin B2, spinosin, 2-hydroxygenistein, dihydrorobinetin and cianidanol）、7种萜类化合物（tripdiolide, (+)-carvone, artemisinin, nerylacetate, (-)-borneol, dulcoside A, and ailanthone）和6种酚类（2,5-dihydroxybenzaldehyde, 7-(4-hydroxyphenyl-1-phenyl-4-hepten-3-one, dihydropinosylvin, punicalagin, vanillin, and metanephrine）。值得注意的是，L-精氨酸是 DEM 最显著上调的 DEM，而7-(4-Hydroxyphenyl)-1-phenyl-4-hepten-3-是 M_24_h 组中最显著的下调 DEM（图4A）。

在M_72_h和CK之间，M_72_h中38个DEMs上调，24 个 DEMs 下调。这些代谢物包括8种类黄酮，包括theaflavin，kaempferol-3-O-rutinoside，naringenin chalcone，isorhamnetin，dalbergioidin，dihydrorobinetin，和anidanol。值得注意的是，dalbergioidin，dihydrorobinetin和anidanol在M_24_h中与CK中的表达存在差异。此外，这些DEM还包括 8 种生物碱，包括3-hydroxy-2-methylpyridine，huperzine B，synephrine，dictamnine，narciclasine，tacrolimus，clivorine，lumichrome和vomicine在M_24_h与CK中也存在差异表达。此外，M_72_h和CK之间的DEM包括5种酚类：4-hydroxybenzaldehyde，kakuol，tetrahydrocurcumin，2,4-dimethylphenol和gentisic acid。同时，在M_72_h和CK之间仅鉴定出2种萜类化合物：simiarenol和linderane。值得注意的是，这些DEM中的大多数在M_72_h组中上调（图4 B）。

除了这些代谢物外，植物激素的变化也很明显。总体而言，这些发现强调了生物碱、类黄酮、酚类和植物激素在增强猕猴桃抗病性方面的关键作用（图 4 A-C）。

进行了RNA-seq分析，以阐明MeJA处理的猕猴桃中 DEMs的分子机制。在0小时（CK/M_0_h）、24小时 （M_24_h）和72 小时（M_72_h）构建了9个cDNA文库。RNA-seq分析分别从M_0_h、M_24_h和M_72_h中产生了6.62、6.57和6.49 G bp 的干净读数，Q30值超过 93.29%，Q20值超过97.68%（表 1）。然后将这些样本读数与参考基因组比对，得到38,046,832到43,338,392个读数的映射读数。平均而言，38,961,984个读数（89.10%）与参考基因组唯一比对，而1610,360个读数（3.56%）映射到多个位置（表 2）。

共鉴定了29,528个表达基因。我们在M_24_h vs. CK、M_72_h vs. CK和M_72_h vs. M_24_h中分别检测到1293、2900和930个DEGs（图5）。DEGs的KEGG富集分析揭示了重要的途径。在M_24_h和CK的比较中，“MAPK 信号通路-植物”（ko04016）、“二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素生物合成”（ko00945）、“苯丙烷类生物合成”（ko00940）、“类黄酮生物合成”（ko00941）和“次生代谢物的生物合成”被确定为最富集的差异途径。同时，在M_72_h与CK的比较中，“内吞作用”（ko04144）、“内质网中的蛋白质加工”（ko04141）、“淀粉和蔗糖代谢”（ko00500）、“碳代谢”（ko01200） 和“氨基酸的生物合成”（ko01230） 被确定为最富集的差异途径。总体而言，这些结果表明，MeJA处理的猕猴桃对灰葡萄孢杆菌的抗性主要归因于苯丙烷类化合物（如类黄酮）的生物合成增强、内吞作用增加以及碳水化合物、氨基酸及其衍生物的加速合成（图5）。

为了确定参与MeJA诱导的抗病性的关键代谢途径和基因，我们对M_24_h vs. CK和M_72_h vs. CK中的DEGs 和DEMs进行了KEGG富集分析。在所有对照组中，高可信度确定的途径包括苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成（苯丙烷生物合成途径的一部分）和植物激素信号转导（M_24_h vs. CK、M_72_h vs. CK和M_72_h vs. M_24_h;图6A-C）。Pearson 相关系数分析显示，DEM 和 DEGs 主要表现出负相关（图6D-F）。总体而言，结果表明，这些途径与 MeJA 诱导的猕猴桃灰霉菌抗性有关。

值得注意的是，在M_24_h与CK和M_72_h与CK的比较中，确定31个DEGs与苯丙烷类生物合成相关（图 7A）。代谢组分析显示，与CK相比，M_24_h和M_72_h 中的关键化合物（如阿魏酸和 5-羟基阿魏酸）上调。此外，这些组大鼠的直接催化基因F5H的表达水平也显著上调。同时，在M_24_h组和CK组之间鉴定出21个用于类黄酮生物合成的DEGs。值得注意的是，大多数类黄酮生物合成DEGs与DEM（-）-表儿茶素一起被确定为下调（图 7B）。

在植物激素信号转导途径中，M_24_h与CK和 M_72_h与CK的比较中分别鉴定出20和46个DEGs。显著改变的基因包括与生长素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯、油菜素类固醇、茉莉酸和水杨酸相关的基因。上调的基因包括JAR1 、 TGA 、 ETR 、 SIMKK 和 EBF1/2 ，而下调的基因包括TIR1 、 AHP 、 DELLA 、 PYR / PYL、 PP2C、 ABF 、 BSK 、 BIN2 和 TCH4。同时，代谢组分析表明，M_24_h组 vs. CK和M_72_h组中茉莉酸水平上调，脱落酸水平下调。此外，发现细胞分裂素水平在 M_24_h组与CK组显著下调，但在M_72_h组与CK组上调（图 7C）。