| 主题 | 绿色猕猴桃粉(Kiwi FFG®)在模拟轻度便秘的人类胃肠模型中的产丁酸、产双歧因子作用和轻度抗炎作用 | ||
| 题目 | Butyrogenic, bifidogenic and slight anti-inflammatory effects of a green kiwifruit powder (Kiwi FFG®) in a humangastrointestinal model simulating mild constipation | ||
| 期刊 | Food Research International | ||
| 中科院分区 | 1区 | 影响 因子 | 8.1 |
| 第一作者 | Elizabeth Goya-Jorge | 通讯 作者 | Véronique Delcenserie |
| 单位 | Univ Liege, Dept Food Sci,Lab Food Qual Management, FARAH Vet Publ Hlth, B43b, B-4000 Liege, Belgium | ||
| 原文链接 | https://webofscience.clarivate.cn/wos/alldb/full-record/WOS:001062990700001 | ||
猕猴桃最早是在十二世纪的中国宋朝被记载。这种植物在19世纪末被引入西方。便秘是最常见的胃肠道疾病之一，据估计，全球约有15%的成年人受到便秘的影响。绿色猕猴桃已被证明可以增加健康受试者的大便频率和稠度，并减少腹部不适。科学证据表明，猕猴桃富含维生素、蛋白质、碳水化合物和膳食纤维，以及高保水能力，对便秘有益。此外, 猕猴桃有抗氧化剂和抗炎作用。然而，只有少数研究报道过：猕猴桃对人体胃肠道的影响，或猕猴桃发酵对代谢和肠道微生物的影响的相关内容。
由于结肠是研究肠道运输最重要的部位，因此在这项工作中设计了几种人类结肠切片的模拟，目的是提供一个彻底的体外分析，来探究绿色猕猴桃粉(Kiwi FFG®)对人类结肠微生物群的影响。利用轻度便秘女性的代表性肠道微生物含量，我们模拟了猕猴桃FFG®存在下微生物生态系统的变化。首次比较了静态/短期结肠发酵与动态/长期肠道模型，两者都测试了标准化的绿色猕猴桃粉。
3.1猕猴桃FFG®在肠道细胞培养实验中没有细胞毒性
MTT和LDH试验结果表明，在5 mg/mL剂量下，Kiwi FFG®对Caco-2细胞没有明显的细胞毒性(见图1)。因此，MTT试验(图1A)显示，在所有测试浓度下，细胞活力高(> 90%)，而LDH试验(图1B)估计细胞毒性低(< 25%)。在4 mg/mL剂量下，细胞活力最大(> 95%)，细胞毒性最小(<10%)。因此，后续实验选用该剂量。
图1 FFG®绿色猕猴桃粉对Caco-2细胞的细胞毒性实验结果(n = 9)。A.不同浓度猕猴桃粉(mg/mL)对细胞作用24 h、48 h和72 h后，MTT法测定细胞活力百分比(平均值±SD)。B. LDH法测定24h后细胞毒性百分比。
3.2 用猕猴桃FFG®治疗会对人类结肠微生物群的代谢产物产生影响
采用两种方法评估猕猴桃FFG®对肠道微生物群代谢产物的影响。首先，对肠道健康生物标志物(即SCFA、乳酸、氨)进行了分析。然后，基于细胞的报告基因分析允许评估猕猴桃结肠发酵输出对AhR信号的影响通路。
短链脂肪酸是细菌厌氧分解人体肠道中不可消化的碳水化合物的主要最终产物。在人体肠道中，钾、钙、镁和氨是主要的阳离子，而scfa是主要的阴离子。这些代谢物的适当平衡是结肠运动的基础，因此在便秘的情况下至关重要。图2和图3分别显示了在静态和动态-SHIME系统中对标准化猕猴桃粉末FFG®模拟发酵过程中SCFA、乳酸和氨的定量结果。
图2 绿色猕猴桃粉Kiwi FFG®处理(2.4 G)在静态人体胃肠模拟(3天)中诱导的SCFA (A-D)、BCFA (E, F)、D/ l乳酸(G)和氨(H)的微生物产量数据以摩尔浓度(μM或mM)表示，误差条为标准差。与平行对照试验比较采用Unpaired t检验或Mann-Whitney检验(视数据正态性而定)，无显著性(ns) 。
图3 FFG®绿猕猴桃粉处理在AC、TC、DC区诱导的SCFA (A-E)、BCFA (F, G)、D/ l -乳酸(H, I)和氨(J)微生物产量动态模拟图中为平均浓度(μM或mM)，误差条为标准差。采用重复测量单因素方差分析或Friedman检验，根据数据正态性进行与预处理对照的比较。与(ns)。
猕猴桃FFG®处理导致肠道生态系统中丁酸盐的产生增加。在静态SHIME®的情况下，在发酵结束时(第3天)可以看到这种效果，如图2C所示。在静态结肠模拟中，猕猴桃处理对其他SCFA、乳酸和氨的微生物产量没有显著影响。
在动态胃肠模拟中，15天后，TC和DC隔间的丁酸显著增加。一旦治疗停止(洗脱期后)，TC的这种增加恢复到初始(对照)水平，如图3C所示。结肠中丁酸盐水平升高被认为是一种积极的健康生物标志物。这种短链脂肪酸加强了上皮防御屏障，对粘膜炎症和胃肠道氧化状态有积极影响。此外，高浓度的丁酸盐可以刺激水和电解质的吸收，从而减少排便量，这对便秘的受试者尤其重要。事实上，在小鼠中补充丁酸盐在慢传输型便秘的情况下显示出重要的益处。我们的体外实验结果表明，标准绿色猕猴桃粉Kiwi FFG®是结肠中丁酸盐分泌的促进剂，这与文献报道一致。
然而，决定猕猴桃通便作用的机制是多因素的，仍有待进一步研究。
在动态-SHIME®模型中，Kiwi FFG®处理期间，丙酸(图3B)在AC和TC中保持相对不变，但在DC部分下降。冲洗期结束后，AC和TC组丙酸产量均有增加的趋势。因此，补充猕猴桃FFG®不影响丙酸的产生。最近一项关于短链脂肪酸在便秘中的作用的研究表明，醋酸和丁酸可以缓解便秘，但丙酸不能。然而，在动态-SHIME®实验中，治疗期间醋酸盐浓度增加的趋势在任何结肠区域都不显著。
同时，猕猴桃FFG®处理导致TC区域异戊酸产量显著下降(图3G)。高水平的粪便支链脂肪酸(BCFA)异戊酸和异丁酸与衰老有关。此外，人类粪便中的异戊酸酯与抑郁症和皮质醇水平升高的阳性诊断相关。
因此，本文观察到的异戊酸的减少与猕猴桃FFG®治疗可以被认为是一个有益的结果。
作为宿主-微生物群相互作用的关键媒介，作者分析了SHIME®系统中猕猴桃发酵肠道代谢输出诱导的AhR转录激活，结果如图4所示。在同时进行的MTT试验中，没有发酵样品导致细胞活力下降超过10%(数据未显示)。
图4 静态-SHIME®实验(A)和动态-SHIME®实验上升(B)、横(C)和下降(D)结肠切片的代谢输出HT29_Lucia细胞AhR折叠诱导。A.在添加2.4 g绿色猕猴桃粉Kiwi FFG®(处理)或不添加猕猴桃粉(对照组)的情况下进行短期发酵(3天)。显示了三个重复批次的技术重复(n = 9)。采用非配对t检验或Mann-Whitney检验(取决于数据正态性)进行比较，无显著性(ns) 。B、C、D.动态-SHIME®实验的三个时间点分别对应于治疗前对照、2周治疗结束和洗脱期结束。显示了三个SHIME®的技术重复(n > 9)，误差条表示标准偏差。采用重复测量单因素方差分析。
在静态体系中(图4A)，发酵24 h和48 h后，与对照实验相比，未观察到显著差异。然而，在最后(72 h)，与对照组相比，AhR交易性下降。相反，猕猴桃FFG®在动态-SHIME®体系中发酵15天后，AhR转录显著增加。
肠道AhR活性与微生物衍生色氨酸分解产物如吲哚和犬尿酸的丰度直接相关。细菌色氨酸代谢物是维持肠道和系统稳态的基础，被认为是宿主-微生物相互作用中的重要信号分子。在治疗15天后，Kiwi FFG®引起TC(图4C)和DC区域(图4D)的AhR转录显著增加(图4C)。即使在停止治疗两周后，在动态-SHIME®中，引起AhR转录激活的代谢物的微生物生产也始终保持不变。这些结果与最近发现的scfa，特别是丁酸盐与肠道微生物衍生的AhR配体的协同作用一致。因此，TC区和DC区丁酸盐浓度的增加(见图3)与人肠细胞代谢池显示的AhR交互活性相关。然而，在静态系统中，在发酵结束时观察到的丁酸盐的增加并不能推断为AhR激活。
这表明，当涉及多种干扰时，丁酸盐对AhR激活的协同效应可能不是线性的，正如在代谢物积累的短期静态发酵中所预期的那样。
3.3 猕猴桃FFG®似乎对Caco-2细胞有轻微的抗炎活性
采用生物发光免疫分析法(Lumit™Technology)检测促炎的人白细胞介素-6 (IL-6)和抗炎的人白细胞介素-10 (IL-10)。Caco-2细胞暴露于增加剂量的猕猴桃FFG®和猕猴桃FFG®在SHIME®系统发酵的上清液。暴露于Caco-2细胞24小时后这些白细胞介素的定量结果如图5所示。
图5 Lumit™检测暴露于绿色猕猴桃粉Kiwi FFG®(A, B)的Caco-2细胞中IL-6和IL-10的产生，在静态SHIME®实验结束(第3天)(C, D)和动态SHIME®实验的三个colon区域(AC, TC, DC) (E, F)上检测IL-6和IL-10的浓度(pg/mL)。结果显示为IL-6和IL-10的浓度(pg/mL)。误差条表示标准差。采用非配对t检验比较猕猴桃粉系列稀释度与无猕猴桃粉(0 mg/mL-水对照)的差异，以及在静态shime®实验中与平行对照的差异。采用重复测量单因素方差分析(Repeated-Measures one - ANOVA)比较动态shime®中预处理对照样本与治疗结束或洗脱期结束时的差异，无统计学意义(ns) 。
所有剂量的猕猴桃FFG®都导致IL-6的产生减少(图5A)，这在一些暴露剂量的测试中是显著的。
例如，1mg /mL, 4mg /mL, 5mg /mL)。如图5B所示，在猕猴桃FFG®的最大暴露浓度(5 mg/mL)下，发现IL-10显著增加。对于其余的暴露剂量，IL-10的产生保持相对不变。
另一方面，静态SHIME®发酵结束(72 h)时的代谢池导致IL-6产量显著下降(图5C)，而与平行对照实验相比，IL-10浓度无显著变化(图5D)。
与静态SHIME®实验结果一致，动态-SHIME®实验AC区和TC区的发酵上清液与预处理控制时间点相比，Caco-2细胞产生的IL-6显著减少(图5E)。因此，猕猴桃FFG®具有轻微的抗炎作用，因为直接暴露和微生物来源的代谢输出都降低了Caco-2细胞产生的IL-6。猕猴桃中丰富的生物活性化合物，如多酚和半乳糖脂，可以减少炎症。此外，猕猴桃蛋白分子如肽kissper在离体和离体人体肠道模型中显示出抗炎和抗氧化潜力。最近，另一项人体胃肠道模拟研究报道了全肠道修复系统(即五种益生菌芽孢杆菌菌株，益生元混合物，免疫球蛋白浓缩物，氨基酸和益生元类黄酮)对Caco-2/THP1共培养中IL-6和IL-10的产生的影响，这有利于炎症性肠病(IBD)的肠道微生物群。
本文提出的代谢物分析表明，猕猴桃FFG®对轻度便秘妇女的结肠生态系统有积极影响。一方面，观察到微生物产生的短链脂肪酸增加，异戊酸BCFA降低，甚至维持氨和D/ l乳酸水平，大肠环境和从管腔吸收过程可能受益。另一方面，激活猕猴桃发酵引起的AhR信号可能与调节结肠上皮细胞的免疫和炎症反应有关。
相应的，猕猴桃发酵产生的微生物衍生代谢物导致IL-6的产生轻度下降。这种多效性促炎细胞因子与结直肠癌血管生成和IBD发病机制有关。
3.4. 长期结肠发酵证实了猕猴桃FFG®对肠道微生物群落的积极影响
为了分析发酵实验中微生物种群的进化，我们测量了已知与肠道生态系统健康直接相关的目标种群。所有目标分类单元的结果以及与静态和动态-SHIME®实验的对照实验或预处理对照的统计比较分别作为补充资料(表S1和S2)。
表S1 在静态shime®实验检测Kiwi FFG®中qPCR检测目标细菌群体的进化。数值对应于使用2-DDCq方法的相对量化。
表S2 动态shime®实验检测Kiwi FFG®的升、横、降结肠区域的qPCR检测目标细菌群体的进化。
表S1显示，在静态-SHIME®实验的3天发酵过程中，猕猴桃FFG®处理对任何目标细菌群落都没有造成很大的影响。事实上，一些产生丁酸盐的群体，如集群IV，集群XIV和Roseburia属，在发酵结束时减少，根据代谢产物分析，丁酸盐含量增加。在发酵的第1天和第2天，嗜粘杆菌数量减少，而在第2天，拟杆菌-普氏菌属数量减少。双歧杆菌属经Kiwi FFG®处理后未发生变化。这些结果可能是静态-SHIME®中高底物损耗率的结果。尽管本文中使用的pH调节可能在某种程度上改善静态发酵中典型的弱微生物控制，但众所周知，有毒产物的积累和细菌种群的生长停滞是间歇发酵系统的局限性。
此外，与平行对照实验相比，其他研究也没有发现模拟绿色猕猴桃胃肠道消化过程中某些细菌种群或微生物丰度的变化。
另一方面，对动态-SHIME®实验的升、横、降号中的13个微生物种群的详细分析显示，猕猴桃FFG®治疗对胃肠道微生物群的总体影响呈阳性和剂量依赖性(图6)。表S2提供了个体值和统计比较。
如图6A所示，在升结肠区域，经Kiwi FFG®处理后，与健康相关的类群如拟杆菌-普氏菌属和双歧杆菌属显著增加。这些结果与之前使用金猕猴桃和绿猕猴桃体外分批发酵模型(48 h)胃回肠消化和粪便发酵的研究一致。
本研究观察到的双歧效应是剂量依赖性的，在治疗第二周结束时达到最大增幅，在洗脱期逐渐下降。
基于特定的微生物定植，证实了丁酸对肠道微生物群的诱导作用。事实上，由于补充了猕猴桃FFG®，在三个结肠区域发现产生丁酸盐的细菌，如F. prausnitzii种和IV群，都有所增加。同样，涉及金猕猴桃(Livaux™)配方的人体临床试验也导致共生F. prausnitzii的增加，据称共生F. prausnitzii是缓解功能性便秘症状和减少肠道炎症的生物标志物。此外，在我们的动态shime®实验中，产丁酸盐的Roseburia属在TC和DC中以无剂量依赖的方式增加，分别如图6B和图6C所示。作为在代谢和抗炎胃肠道过程中发挥重要作用的微生物群落，Roseburia的增加被认为是猕猴桃处理的一个非常积极的结果。
我们认为猕猴桃FFG®在模拟微生物生态系统中的另一个积极影响是促进了黏液降解细菌a . muciniphila的显著增加(TC)(图6B)。同样，其他作者也报告了金果肉猕猴桃处理后Akkermansia属的数量增加。嗜muciniphila是一种肠道共生体，建议作为新一代治疗性益生菌的一部分。其功能之一是调节粘液厚度和肠道屏障完整性。此外，肠道微生物群中嗜粘杆菌的存在是人类心脏代谢健康的生物指标。
图6 绿色猕猴桃粉猕猴桃FFG®动态-SHIME®实验中，qPCR检测的目标菌群在升(A)、横(B)和降(C)结肠区域的进化。热图中表示的平均值对应于使用2-ΔΔCq方法的相对量化。详细的图形表示，包括误差测量和统计比较，作为补充材料(表S2)。(读者可参阅本文的网页版本，以了解此图例中有关颜色的解释。
代谢产物分析显示，猕猴桃粉具有显著的产丁酸作用，并且在动态胃肠道模型中，产丁酸菌(即Faecalibacterium prausnitzii, Cluster IV, Roseburia spp.)的数量也显著增加。双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)在升结肠和横结肠的菌群中也被发现增加，而嗜粘杆菌(Akkermansia muciniphila)在横结肠中也被发现显著增加。利用人肠道细胞(HT-29)进行的报告基因检测表明，猕猴桃发酵代谢产物激活了芳烃受体(AhR)转录途径，这是肠道稳态和免疫的重要调节因子。
此外，在Caco-2细胞中调节人类白细胞介素(IL-6和IL-10)的产生表明猕猴桃粉及其肠道微生物衍生代谢物具有潜在的轻度抗炎作用。研究结果表明，猕猴桃FFG®在肠道微生物群中具有潜在的健康益处，特别是在便秘的人群中。
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文献解读：毛碧莹
编辑：毛碧莹
校稿：赵沁雨
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