125 用交叉组学方法了解钙在猕猴桃成熟过程中的作用及早晚反应机制的建立

钙是细胞膜和细胞壁的重要结构成分，在采后果实成熟过程中保持膜的完整性和细胞壁的强度。除结构作用之外，钙的主要功能在于其在各种过程中充当第二信使的能力。许多下游基因、蛋白质和关键的果实成熟代谢过程都受到Ca²⁺ 信号的调节。有研究表明在猕猴桃软化过程中，乙烯是猕猴桃成熟的主要调节因子，但乙烯依赖和乙烯相互依赖的调节途径必须共存以协调成熟。尽管目前已知钙参与猕猴桃软化过程中细胞壁的修饰，但从未有研究尝试过在成熟的猕猴桃中对基因，蛋白质和代谢物响应钙的变化进行全局表征。

该研究以"海沃德"猕猴桃为试材，从生理和分子水平全面分析了钙对猕猴桃采后成熟的影响。值得注意的是，虽然大多数研究探讨了钙在果实成熟过程中的长期影响，但该研究的一个显著特点是在钙施用后和成熟过渡期间对猕猴桃组织进行取样，以揭示与钙施用的早期和晚期反应相关的转录组学、代谢组学和蛋白质组学重编程的潜在差异和变化动力学。

在浸渍8小时后，暴露于外源钙中果实中的内部钙含量持续增加（图1A）。用Fluo-3 AM检测的猕猴桃细胞内Ca²⁺信号的空间成像表明，游离钙离子的中心主要是从果皮内到果皮外的区域和维管组织中（图1B，C）。

对各种成熟性状的分析显示，在果实成熟期间，钙处理的猕猴桃在3至5天之间记录到SSC的减少，而TA在5天减少（图1D）。乙烯产量在成熟第0天和第7天因钙的反应而减少（图1E），而呼吸速率不受影响。在钙处理的果实中，果皮硬度0天开始就保持高于对照，并保持这种趋势直到7天。此外，暴露于钙的猕猴桃中3至7天的中轴胎座硬度高于对照（图1E）。

通过荧光显微镜对果胶和阿拉伯半乳聚糖表位的组织化学分析显示，在经历钙浸渍的猕猴桃中，脱酯化的同型半乳糖醛酸聚糖（HG）（抗体LM19）和阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP）（抗体JIM 13和LM30）的检测水平降低（图1F、G）。

在猕猴桃果皮组织中共检测到45种初级代谢物。代谢产物可分为5类，即有机酸类（16种）、氨基酸类（3种）、可溶性糖类（16种）、醇类（5种）和其他化合物类（5种）。通过主成分分析（PCA）进行的代谢物分类显示总方差为37.1，其中23.8%和13.3%分别由PC1和PC2解释（图2A）。PC1可将钙的早期和晚期反应的代谢物分离。初级代谢物分析表明，27种化合物因钙的反应而发生变化。 

在有机酸中，乙醇酸和柠康酸作为对钙的早期反应而增加，而柠康酸和苏糖酸在反应后期积累（图2B）。草酸在成熟3天时减少，并保持相同的趋势直到7天（图2B）。琥珀酸、柠康酸、羟基戊二酸和苹果酸在第1天时减少，苹果酸也在第7天时减少（图2B）。关于氨基酸，在早期观察到氧代脯氨酸的诱导，而在成熟5天时，所有检测到的氨基酸，包括丝氨酸、氧代脯氨酸和GABA，都因钙的反应而增加（图2B）。在钙处理的果实中，赤藓糖和塔罗糖在第1天减少，而在同一时间点海藻糖、乳果糖和松二糖增加（图 2B）。经过钙处理的猕猴桃冷藏后，乙醇胺和磷酸减少，而半乳糖醇增加（图2B）。在酚类化合物中，表儿茶素和原花青素 B2 作为对钙的早期反应而减少，而表儿茶素在成熟 3 d 时增加（图2C）。作为对钙的后期反应，抗坏血酸的水平在成熟的第 1 天和第 5 天降低（图2C）。

整体转录组分析揭示了钙处理猕猴桃与对照猕猴桃在钙反应早期和晚期的果皮组织中存在几个差异表达基因（DEG）（图3A）。为了响应钙，许多基因的表达在测试的两个时间点发生了变化（图3B）。特别是，89个DEG（其中88个基因下调）在早期被检测到，而370个DEG（253个基因上调和117个基因下调）被确定为对钙应用的晚期反应（图3B）。

基因表达分析还表明，在早期阶段，检测到了34个高度下调（log₂ FC≤-2.5）的DEG（图3C）。这些DEG分为8类，包括乙烯、钙、线粒体载体蛋白、蛋白磷酸酶、受体样激酶、与Zing指结构基序相关的基因、核酸酶和泛素转移酶（图3C）。

在反应后期，检测到 29 个高度上调的 DEG (2≤log₂ FC)（图3E），分为 12 类，包括主要过敏原、果胶酯酶和含有 NAC 结构域的蛋白质（图 3E）。同时，在反应后期鉴定出28个高度下调的DEG（log FC≤−1）（图3F），分为7类，包括与RCD1蛋白、蛋白NRT1/PTR和泛素蛋白相关的基因（图3F） 。在后期高度上调和下调的DEG之间，鉴定出5类DEG，包括与乙烯、钙、木葡聚糖、生长素和半胱氨酸/组氨酸相关的基因（图3G）。

关于细胞壁和膜相关的DEG，早期鉴定了25个DEG，分为5类。在反应后期，检测到大量与细胞壁和细胞膜相关的基因（150 DEG）。

该研究发现钙改变了早期反应的19个TF和晚期反应的31个TF的表达（图4C、4D）。

通过nano LC-MS/MS 分析，在果皮样品中总共鉴定出4594个蛋白质组。PCA显示总方差为47.9，其中PC1和PC2分别解释了37.4%和10.5%。PC1可良好分离钙的早期和晚期反应蛋白质。如火山图所示，钙施用后差异积累蛋白质（DAP）的积累模式在测试的两个时间点改变（图5A）。与对照相比，在钙处理的猕猴桃中，9个DAP（7个向上积累的蛋白质和2个向下积累的蛋白质）和890个DAP（576个向上积累的蛋白质和314个向下积累的蛋白质）在早期和后期分别改变了它们的丰度（图5B）。然后基于功能富集分析，将鉴定的DAP分类为基因本体（GO）结构域的三个类别（即BP、MF和CC）。

为了进一步评估钙对猕猴桃成熟的影响，确定了两个阶段的高度积累的蛋白质（2≤差异≤–1.5）（图5C）。该数据集中总共发现了52个DAP，包括与水通道蛋白 (AcAQP.1-3、6-5)、钙 (AcCBEFh.3、AcCDPK.2) 和阳离子 (AcCTL) 转运蛋白以及线粒体载体蛋白 (AcAAC.2) 相关的蛋白质。1-3、AcMCF.1-2、AcMCP.1-2、AcMPCP.1-2）（图 5E）。使用先前提到的 RNA-seq 分析中的 KGD 工具研究了钙处理对转录因子 (TF) 相关蛋白表达的影响。虽然早期没有检测到转录因子（图5F），但后期钙改变了11个转录因子的丰度。这些TF被分为9个家族，包括AP2/ERF-ERF、WRKY、HMG、Trihelix、C3H、GRAS、CSD、GNAT和ARID（图5F）。

经过WGCNA分析，合并动态树切割方法揭示了五个模块（ME），即蓝色、灰色、黑色、棕色和黄色（图6A）。其中，棕色和蓝色模块显示的基因、蛋白质和代谢物数量最多（图6A）。在蓝色模块中，对于钙的后期反应，与对照相比，经过钙处理的猕猴桃表现出较低的相关系数（图 6B）。同时，在棕色模块中，与蓝色模块相比，后期钙暴露的果实表现出比对照更高的相关系数（图6B）。基于WGCNA的边缘Cytoscape结果构建了位于蓝色、棕色和黑色模块中的基因、蛋白质和代谢物的调控网络（图6C）。蓝色模块（蓝色ME）由94个注释基因、165个蛋白质和11个代谢物组成。其中，1个代谢物、7个蛋白质和3个TF与基因连接（图6C）。棕色模块（brown ME）由72个注释基因、142个蛋白质和3个代谢物组成（补充表S9）；其中，10个TF与基因相关（图6C）。最后，黑色模块（black ME）由90个注释基因、31个蛋白质和2个代谢物组成（补充表 S9）。在黑色ME中，发现3个蛋白质和16个TF与基因相关（图 6C）。

通过转录组和蛋白质组分析单独检测到的分子变化被纳入蛋白质组学方法中。研究结果表明，总体以及早期和晚期反应转录本和蛋白质丰度表现出对称分布（图7A）。Pearson 相关分析显示蛋白质组和转录组数据之间的所有成对比较均呈正相关值（图7B）。钙处理果实的转录组和蛋白质组的早期和晚期反应均高度相关（图7C）。每次比较的转录组和蛋白质组的相关性以散点图呈现（图7C）。对照和钙处理的猕猴桃的转录本与转录本以及蛋白质与蛋白质的关系都显示出高相关值（图7C）。然而，与蛋白质组相比，钙处理水果的转录组与对照样品的转录组显示出较低的相关值（图7C）。值得注意的是，对照水果和钙处理水果之间的晚期反应蛋白的相关值最高（图7C）。

为了确定猕猴桃中钙作用的关键分子特征，确定了在每个数据集中表现出统计显着差异（以相同趋势减少或增加）的常见基因和相应蛋白质（图8A）。在早期反应阶段，没有一个基因具有相应的已识别蛋白质产物，而在晚期反应阶段，发现了14对基因-蛋白质（图8B）。利用KGD工具进行功能注释，以确定受钙影响的关键途径。这种分析方法揭示了与细胞壁重塑、蛋白质泛素化、钙调蛋白、乙烯、抗坏血酸和半胱氨酸相关的途径受到猕猴桃中钙补充剂的强烈影响（图8C）。