| 主题 | 转录组分析鉴定出一种转录抑制因子：BES1-互作MYC-LIKE1，调控软枣猕猴桃采后果实的快速软化 | ||
| 题目 | Transcriptome analysis identified a transcriptional repressor,BES1-INTERACTING MYC-LIKE1 regulating rapid postharvest fruitsoftening of Actinidia arguta | ||
| 期刊 | Postharvest Biology and Technology | ||
| 中科院分区 | 1区 | 影响 因子 | 6.4 |
| 第一作者 | Jian Wang | 通讯 作者 | Yan-chang Wang |
| 单位 | Chinese Acad Sci, CAS
Key Lab Plant Germplasm Enhancement & Specialt, Wuhan Bot Garden, Peoples R
China | ||
| 原文链接 | https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925521424003521?via%3Dihub | ||
猕猴桃快速软化是猕猴桃采后贮藏的主要问题之一，它会导致猕猴桃品质恶化，降低商品价值。从分子水平上了解猕猴桃成熟和软化的机理，有助于培育具有良好贮藏性能的猕猴桃品种。通过对猕猴桃采后成熟过程的分析，发现果胶的增溶作用和半纤维素的解聚作用是猕猴桃果实软化的主要原因。基于RNA-seq数据和加权基因共表达网络分析(WGCNA)，揭示了4个细胞壁降解相关基因AaPG1、AaXTH28和AaPME1/2。通过双荧光素酶法和酵母单杂交鉴定了bHLH转录因子AaBIM1，该转录因子是细胞壁降解相关基因的转录抑制因子，其表达谱在采后成熟过程中呈下降趋势。猕猴桃果芯组织中AaBIM1的过表达延迟了果实软化，降低了下游结构基因的表达。这些发现支持了AaBIM1在调节细胞壁代谢中的关键作用，并为进一步通过育种改进猕猴桃软化提供了见解。
软枣猕猴桃(Actinidia arguta)，俗称耐寒猕猴桃，是一种多年生落叶藤本植物，主要分布在中国、朝鲜、日本和俄罗斯远东地区。其果实体积小，表皮光滑可食用，是一种非常有商业前途的水果物种。它具有独特的芳香风味，并含有促进健康的化合物，包括矿物质、维生素、多酚和类胡萝卜素。然而，猕猴桃是典型的跃变型水果，其软化过程极快，因此在采后储存和运输方面存在很大困难。在过去的几年里，人们尝试了一些延长猕猴桃保质期和保持采后质量的方法，尽管其中一些方式已经取得了相当大的进展，但仍然迫切需要开发具有较长储存寿命的新品种。
软化是水果成熟过程中一个重要的指标。对于大多数肉质水果来说，软化是细胞壁成分降解和细胞粘附减少的必然结果。植物原代细胞壁由果胶、纤维素(CEL)、半纤维素(HEM)和糖蛋白组成，在果实软化过程中，伴随着果胶的增溶、纤维素和半纤维素的解聚。据报道，一系列细胞壁修饰酶参与了这一过程，如果胶甲基酯酶(PME)、果胶裂解酶(PL)、聚半乳糖醛酸酶(PG)、木葡聚糖内转糖基化酶/水解酶(XTH)、内-1,4-β-葡聚糖酶(EGase)和扩张酶(EXP)。然而，水果软化是一个复杂的过程，需要多种细胞壁调节剂协同作用。与商业化程度较高的中华猕猴桃相比，尽管通过比较转录组分析已经鉴定出了几种猕猴桃成熟相关转录因子(tf)，但对软枣猕猴桃成熟和软化机制的研究相当有限。
近年来的研究陆续强调了转录调控在各种水果细胞壁修饰和果实软化中的关键作用。猕猴桃软化的转录调控机制已经在模式水果中得到了证实，但与猕猴桃软化相关的研究主要集中在细胞壁代谢和酶活性方面。本研究旨在揭示猕猴桃软化过程中的关键转录因子，并阐明其潜在的调控机制。通过生理生化分析，结合转录组学数据，揭示了猕猴桃采后快速软化的4个结构基因(AaPG1、AaXTH28和AaPME1/ 2)。此外，我们发现了一个基本的螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子bes1，与MYC-LIKE1 (AaBIM1)相互作用，作为细胞壁降解相关基因的转录抑制因子。采后成熟过程中AaBIM1积累减少，导致AaPG1、AaXTH28和AaPME1/2转录本增加，显著加快猕猴桃软化过程。这些结果强调了AaBIM1在猕猴桃细胞壁代谢中的重要作用，也为猕猴桃品种的选择和育种提供了策略。
实验结果
3.1. 猕猴桃细胞壁成分的变化
为了研究猕猴桃的成熟和软化过程，对猕猴桃采后4个阶段(采后0、2、4、6天，DAH)进行了生理分析。“丹阳LD133”猕猴桃的初始硬度为86.63 N，收获后4天，果实过渡到可食用状态，硬度为8.65 N(约降低了10倍)，果实表面明显起皱(图1A)。相比之下，TSS从0 DAH时的7.45%增加到4 DAH时的12.44%(图1B)。
细胞壁代谢是水果软化研究中的一个重要问题。
如图1C所示，猕猴桃在采后成熟过程中，细胞壁成分发生了巨大变化。其中，HEM和CBP的含量表现出与果实硬度相似的规律，在4 DAH时表现出显著的下降。相反，WSP含量在整个成熟期呈上升趋势，从0 DAH时的9.59 mg/g上升到6 DAH时的35.22 mg/g。然而，在采后成熟过程中，CEL和ISP的含量呈现动态变化，即CEL在4 DAH时达到最大值，而ISP在4 DAH时达到最小值(图1C)。这些观察结果强调了果胶增溶和HEM解聚在猕猴桃软化过程中可能发挥的关键作用，并为揭示参与这一过程的潜在基因提供了见解。
图1所示。‘丹阳LD133’猕猴桃采后成熟的生理变化。(A)完整猕猴桃在室温(20◦C)下自然成熟6 d。(B)猕猴桃采后成熟过程中的果实硬度和总可溶性固形物。(C)猕猴桃采后成熟过程中细胞壁成分。CWM:细胞壁材料;CEL,纤维素;HEM,半纤维素;WSP水溶性果胶;ISP:离子可溶性果胶;CBP共价结合果胶。红色五角形图表示与猕猴桃软化密切相关的细胞壁成分。(B)和(C)中的误差条分别表示8次和3次重复的标准误差。
3.2 细胞壁降解候选基因的鉴定
为了研究猕猴桃软化的潜在基因，作者对12个mRNA文库(0、2、4、6个DAH，每个有3个生物重复)进行了RNA-seq分析。在12个样本中，排除了最大FPKM < 1的基因，其余70115个用于转录组分析。
转录组学分析显示猕猴桃样本中有19164个差异表达基因(DEGs)。在12份样本中去除最大FPKM < 5的基因后，共将10668个基因放入WGCNA程序。共表达网络分析将这些deg分为13个单独的模块(图2A)，其中“绿松石色”、“蓝色”和“棕色”模块与所有这些性状(包括硬度、HEM、WSP和CBP)的相关性最高。进一步选择依据两个标准:(1)模块绝对隶属度(MM)值> 0.85;(2)任何性状的绝对基因显著性(GS)值均大于0.9。总的来说，共有1952个基因被指定为候选基因(图2B;补充表S4)。
随后对1952个候选基因的KEGG富集分析表明，其中大多数与次生代谢物的生物合成和代谢途径有关。
基于功能注释筛选细胞壁相关基因，确定了4个可能参与果胶和HEM降解的结构基因，包括AaPG1 (Aa3Ag128125)，AaXTH28(Aa7Bg151108),AaPME1(Aa16Cg36963),AaPME2 (Aa17Cg44464)。
这些细胞壁降解相关基因的表达在4 DAH时被显著诱导，并在6 DAH时保持升高(图3A)。
图2所示。猕猴桃采后成熟过程加权基因共表达网络分析。(A)转录组共表达基因的13个模块的簇状树突图。(B)模-性状关系及对应的p值。与性状数据相关度最高的三个模块用红框突出显示。HEM,半纤维素;WSP水溶性果胶;CBP共价结合果胶
图3所示。细胞壁降解相关基因(A)和候选转录因子(B)的表达谱。红色五角形图表示用于后续调控作用分析的转录因子。误差条表示三个重复的标准误差。
3.3. TFs对细胞壁降解相关基因的体内调控
为了揭示这四种细胞壁相关基因的转录调控机制，我们在前面提到的1952个候选基因中对软化相关tf进行了全面筛选。氧化石墨烯富集分析显示了80个具有转录因子活性的潜在基因。其中，我们重点选取对数倍绝对值变化最大的前15个tf，分析其表达模式。如图3B所示，一些tf在不同样品间的基因表达再现性较差(如Aa3Bg130191、Aa10Bg01556、Aa13Ag15844)，而另一些tf的基因表达模式与硬度变化不一致(如Aa7Bg151864、Aa21Bg72011、Aa26Dg104001)。此外，利用在线PlantCARE数据库分析细胞壁降解基因启动子的顺式作用元件，结果表明这些启动子含有MYB、WRKY、MYC、bHLH和dof结合元件。
考虑到它们的表达模式和功能注释，作者最终选择了2个DOF家族TF (Aa11Ag05428/Aa11Dg08929)、2个bHLH家族TF (Aa16Bg35688/Aa18Ag46096)和1个WRKY家族TF (Aa15Dg32991)来测试其调控作用(图3B，红色五边形突出显示)。
将4个细胞壁降解相关基因的启动子重组到pGreen II 0800-LUC载体中，并将5个候选TFs全长插入到pGreen II 0029 62-SK载体中。双荧光素酶测定确定潜在的监管效果。结果显示，bHLH家族TF中的AaBIM1 (Aa16Bg35688)是一种广谱转录抑制因子，可显著抑制这四种细胞壁降解相关基因的启动子。然而，其他4种TFs的作用有限(图4)。另外，AaBIM1的表达谱在采后成熟过程中呈下降趋势(图3B)，这可能导致AaPG1、AaXTH28和AaPME1/2的上调；作者进一步克隆了“Hongsheng”(中华猕猴桃)中AaBIM1的同源基因，并测试了其对细胞壁降解相关基因启动子的调控作用。结果显示，AcBIM1也会反抑制它们的启动子活性。
图4所示。候选转录因子对细胞壁降解相关基因启动子的调控作用。空载体(EV)加启动子的LUC/REN之比设为1。LUC/REN的相对值低于0.5或高于2.0被认为是有效的调节器。误差条表示三个重复的标准误差。
3.4. AaBIM1的基序分析及dna结合活性
由AaBIM1和番茄(一种软化研究的模式果实)中所有bHLHs氨基酸序列组成的系统发育树分析表明，AaBIM1与16亚族的SlbHLH023和SlbHLH046关系最为密切(图5A)。对来自亚族16的AaBIM1和SlbHLHs的多个序列比对显示，它们的bHLH结构域高度保守(图5B)。这些bHLH蛋白的碱基区含有17个氨基酸，这与之前的研究结果一致。在基本区，保守残基His-9、Glu-13和Arg-16在靶基因启动子的识别和结合以及随后的转录调控中发挥重要作用。此外，乙烯响应因子相关的两亲性抑制(EAR)基序，已知决定靶基因的转录抑制，在AaBIM1的c端发现(图5B)。当AaBIM1的EAR基序从LPLSL突变为LPKSQ(称为AaBIM1m)时，其对AaPG1、AaXTH28和AaPME1/2启动子的转抑制作用消失(图5C)。
AaBIM1- gfp融合蛋白在烟叶中的瞬时表达表明，AaBIM1位于细胞核，这与大多数tf相似(图5D)。为了确认AaBIM1与细胞壁降解相关基因启动子的结合，我们进行了Y1H测定。
对Aureobasidin A (AbA)最小抑制浓度的测定表明，AaPME2启动子在酵母中具有自激活作用，因此仅测试了AaBIM1与AaPG1、AaXTH28和AaPME1启动子之间的物理相互作用。AaBIM1的共表达诱导了由AaPG1、AaXTH28和AaPME1启动子驱动的抗性报告基因AbA的表达，表明AaBIM1在酵母中可以直接结合这些启动子(图5E)。
图5所示。AaBIM1的基序分析及dna结合活性。(A) AaBIM1和SlbHLHs的邻接系统发育树。(B)来自亚族16的AaBIM1和SlbHLHs的高度保守的bHLH结构域。AaBIM1中的EAR基序用蓝框表示。(C) AaBIM1中EAR基序的位点突变。指出了野生型和突变型的推定氨基酸序列。空载体(EV)加启动子的LUC/REN之比设为1。误差条表示三个重复的标准误差。统计分析采用双尾Student 's t检验(ns，无显著性)。(D) AaBIM1-GFP在转基因benthamiana叶片中的亚细胞定位(用定位核的mCherry表达)。bar = 50 μm。(E)酵母单杂交实验显示AaBIM1与AaPG1、AaXTH28和AaPME1启动子的物理相互作用。AbAx表示AbA的添加量为x μg/L。空AD载体与相应启动子相互作用作为阴性对照
3.5 AaBIM1过表达延迟猕猴桃软化
考虑到猕猴桃稳定转化的局限性和难度，我们在“龙城2号”猕猴桃果芯组织(商品成熟时收获，初始硬度为88.24 N)中进行了瞬时过表达实验，以证实AaBIM1在调节果实软化中的作用(图6A)。浸渍后，由于机械损伤，果实硬度急剧下降，而注入AaBIM1的果实硬度相对于空载体浸渍的果实保持较高(图6B)。对CWM成分的测定表明，AaBIM1的瞬时过表达延迟了HEM和果胶的降解，对CEL的影响有限(图6C)。AaBIM1浸润后1和2 d, AaBIM1转录本的丰度显著增加(图6D)。相反，下游结构基因AaPG1、AaXTH28和AaPME1/2的表达显著下调(除AaPME1在浸润后1 d)，表明AaBIM1在调节细胞壁降解和猕猴桃软化方面的作用(图6E)。
图6所示。AaBIM1在猕猴桃核组织中的瞬时过表达。(A)瞬时表达实验示意图。用35s:AaBIM1或空载体浸润猕猴桃核心组织。(B)浸渍后猕猴桃果实硬度。(C)浸渍后猕猴桃细胞壁成分含量。HEM,半纤维素;WSP水溶性果胶;CBP共价结合果胶。(D)浸渍后猕猴桃中AaBIM1的相对表达量。(E)下游细胞壁降解相关基因的相对表达。(B)中的误差条表示八个重复的标准误差;(C)、(D)和(E)中的误差条表示三个重复的标准误差。
在这项研究中，作者分析了猕猴桃采后的成熟过程，强调果胶溶解增多和HEM解聚是水果软化的主要因素。共筛选了1952个与猕猴桃软化相关的候选基因，筛选出4个果胶和半纤维素修饰因子AaPG1、AaXTH28和AaPME1/2。我们进一步鉴定了AaBIM1是细胞壁降解相关基因的转录抑制因子，其表达谱在成熟过程中呈下降趋势。AaBIM1在猕猴桃核心组织中的瞬时过表达降低了细胞壁降解相关基因的表达，延缓了果实软化。总的来说，采后成熟过程中AaBIM1积累的减少导致AaPG1、AaXTH28和AaPME1/2转录本的增加，从而显著加速了猕猴桃的软化。下一步的研究将集中在AaBIM1在软枣植物中的稳定转化，以及阐明软枣和中国软枣果实软化速率差异的分子机制。
本文图表均来自本文献
文献解读：毛碧莹
编辑：毛碧莹
校稿：赵沁雨
审核：马婷婷
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