126 核黄素光敏化作用降低猕猴桃采后对灰霉病的易感性

1.核黄素光敏化作用降低猕猴桃采后灰霉病的严重程度

猕猴桃贮藏8天后，在接种部位周围出现明显腐烂（图1A-B）。外源性核黄素处理对灰霉菌生长具有抑制作用，并通过与LED蓝光照明的组合（photosensitization，光敏化处理）来增强这种作用。直到贮藏第4天观察到猕猴桃出现灰霉病变，之后扩大（图1B）。核黄素处理果实病斑直径低于对照，photosensitization处理后病斑直径的减少更为显著。有趣的是，LED单独处理对病斑直径没有显著影响。

接种4天后发生快速软化（图1C）。核黄素相关处理在贮藏过程中保持较高硬度。在贮藏后期（第6天和第8天），photosensitization处理果实硬度显著高于仅用核黄素处理的果实，表明其维持性得到加强。关于失重率，仅在photosensitization处理中观察到其水平低于对照组（图1D），而LED处理的水果显示出更高的失重率水平，单独核黄素处理没有显著差异。关于SSC，其水平在增加6d后下降（图1E）。3种处理均加速了贮藏后期（第6和/或第8天）SSC的下降，其中LED处理的作用最为显著。核黄素单独处理及photosensitization处理的SSC没有显著差异，直到贮藏第8天，与核黄素处理果实相比，photosensitization处理的SSC减少。

图1 核黄素光敏化处理后猕猴桃灰霉病表现型及品质性状。

2.核黄素光敏化作用减轻氧化应激

所有组的猕猴桃在贮藏期间MDA水平增加（图2A）。3种处理均能降低MDA的积累，其中photosensitization处理的果实在贮藏结束时MDA的积累量分别比对照和单独核黄素处理的果实减少了18.9%和28.5%。至于H₂O₂，其含量在整个实验期间增加（图2B）。不同处理对果实中H₂O₂含量增加均有不同程度的抑制作用。photosensitization处理果实相对于单独核黄素处理的果实没有表现出显著差异，除了贮藏第2天和第8天，相比于单独核黄素处理分别增加16.7%和减少32.2%。

图2 核黄素光敏化处理猕猴桃在25℃贮藏8天的氧化应激情况。

3.核黄素光敏化作用不改变能量状态

所有果实中的ATP含量最初都有所增加，然后下降（图3A）。与对照相比，核黄素处理的果实在贮藏前4天有较高的ATP水平，然后差异消失。然而，在photosensitization处理果实中，ATP含量高于对照的时间较长（长达8天）。LED蓝光照射10min与对照组相比，ATP水平无显著性差异。所有组的果实都表现出ADP含量的增加，在贮藏结束时下降（图3B）。与ATP类似，在接种后的前4天，核黄素处理的果实中观察到更高水平的ADP，而直到第6天才观察到photosensitization处理的促进作用，但又在贮藏结束时急剧减少。AMP含量在贮藏期间显示出增加趋势（图3C）。LED处理在大部分贮藏期内对AMP的积累无显著影响，而单独核黄素和光敏化核黄素处理对AMP的积累有显著并不同的影响。对于核黄素处理果实，在整个贮藏期间观察到较低水平的AMP，贮藏结束时减少20%。相反，光敏化核黄素处理在后期（4天后）增加AMP含量。结果表明，光敏化作用显著改变核黄素对AMP模式的影响。在整个实验期间，发现能荷普遍下降（图3D）。核黄素相关处理的果实在大部分贮藏期内的能荷水平均高于对照，而photosensitization处理的果实与单独核黄素处理的果实相比，能荷水平略有降低，但差异不明显，表明光敏化处理对核黄素提高能荷水平的影响很小。

图3 核黄素光敏化处理猕猴桃的能量状态。

4.核黄素光敏化作用维持电子传递

研究了与线粒体功能和电子传递相关的四种标记酶的活性。所有组的果实在H⁺-ATPase活性先增加后下降（图4A）。核黄素处理组在第2天达到峰值，早于其他组，其他组在第4天达到峰值。所有涉及LED蓝光处理的果实都表现出对H⁺-ATPase活性的促进作用。相反，单独核黄素处理显著降低H⁺-ATPase活性，表明核黄素光敏化后逆转了单独核黄素处理引起的H⁺-ATPase活性降低。在所有果实中观察到Ca²⁺-ATPase活性先增加后下降（图4B）。photosensitization处理的高峰期（第2天）比其他组提前2d。所有经过处理的果实均表现出比对照组高的Ca²⁺-ATPase活性，其中photosensitization处理的果实在第2天的Ca²⁺-ATPase活性比单独核黄素处理的果实显著提高了83.7%。所有组中的SDH活性均先升高后下降（图4C），核黄素相关处理均呈现出比对照更高的水平，在贮藏期间平均增加40%。在第2天，photosensitization处理的SDH活性比单独使用核黄素有2倍的增加，之后略有波动。在核黄素相关处理和对照中观察到CCO活性的增加，不同于LED蓝光照明果实的CCO活性在第2天达到峰值，然后急剧下降（图4D）。在整个实验期间photosensitization处理表现出显著高于对照组的水平，不同于单独核黄素处理仅在第6天至第8天显著高于对照组，表明通过光敏化作用增强的CCO活性强烈且持久。

图4 核黄素光敏化处理猕猴桃的电子传递相关标记酶的活性。

5.核黄素光敏化作用加速茉莉酸的生物合成和积累

研究了JA含量及其生物合成，以进一步了解增强抗性与JA之间的联系。结果显示，所有组的JA含量均增加，并在第4天达到峰值，然后逐渐下降（图5A）。除贮藏结束外，核黄素相关处理在整个贮藏期间的含量均高于对照。与单独核黄素处理相比，核黄素光敏化处理在贮藏第2天到第4天的JA含量略有增加，这与内源性核黄素水平变化相对应，表明光敏化作用促进了JA的早期合成。

为了解释JA含量的变化，检测了JA生物合成相关基因的转录水平。所有处理早期都改善了基因转录本丰度的积累，并在贮藏结束时减少（图5B-E）。例如，与对照相比，在前六天用核黄素处理的果实中AcLOX3、AcOPR11和AcJAR1的转录水平较高（图5B、D和E），而AcAOS转录水平仅在第4天短暂增加，表明JA积累与AcLOX3、AcOPR11和AcJAR1的表达更密切相关。在最初的四天内，所有基因都因光敏化核黄素处理瞬时上调，比单独使用核黄素更早。此外，光敏化核黄素暂时改善了除AcLOX3外的基因上调。一般来说，光敏化核黄素加速基因的转录诱导，与JA含量的波动一致。

图5 核黄素光敏化处理猕猴桃的茉莉酸生物合成情况。

6.核黄素光敏化作用缓解早期蔗糖转化

除LED处理的果实糖含量呈持续上升趋势外，其他处理糖含量均先上升后下降。与对照相比，核黄素相关处理通常在第一阶段表现出糖的增加，但在后期表现出糖的减少（图6）。例如，photosensitization处理的果糖含量在第4天比对照高50%，但在第6天较低（图6A）。相反，核黄素处理的果实与对照相比没有显著差异。值得注意的是，在大部分时间内，核黄素相关处理的果实中葡萄糖和总糖含量显著高于对照（前6天，图6B和D）。然而，LED处理在整个实验期间呈现对葡萄糖的抑制作用，这可能解释了与单独核黄素处理相比，photosensitization处理出现葡萄糖和总糖水平较低的现象。关于蔗糖，核黄素相关处理在第2天的蔗糖水平显著高于对照，而在第4天，增加现象消失，之后观察到显著更低的水平（图6C）。相比于单独核黄素处理使蔗糖含量增加3倍，光敏化核黄素处理显示出更显著的增强，在第2天时相比于对照增加6倍。这些结果表明，核黄素损害了蔗糖的积累，但提高了葡萄糖的含量，而核黄素光敏化作用在早期（第2天和第4天）有效地促进了蔗糖和果糖的积累，以及整个阶段抑制葡萄糖积累；此外，光敏化作用加速了总糖和单糖峰值的出现（提前2天）（图6）。

图6 核黄素光敏化处理猕猴桃的糖含量。