143通过酵母诱导的内生微生物组调节可以增强猕猴桃对灰霉病的抵抗力

猕猴桃在采后加工、储存和销售过程中易受到真菌感染造成腐烂。灰霉病是猕猴桃的常见病害，由灰霉菌引起，严重危害猕猴桃产业的发展。目前，主要使用化学杀虫剂控制灰霉病。然而，公众对合成化学品的健康、食品安全和环境污染问题始终保持怀疑态度，因此急需开发新颖、安全和环保的控制措施。基于微生物相互作用的生物防治策略因其其安全性和生态效益而受到广泛关注，并已被证明在减轻蔬菜和水果的腐烂方面具有广泛的潜在应用。近年来，越来越多的研究揭示了植物微生物组在植物健康和生长中发挥的重要作用。越来越多的证据表明，植物病害的发生与微生物群落结构有着错综复杂的联系，为植物病害的防控提供了新的范例。各种酵母菌已被用作采后疾病管理的有效生物防治剂。然而，酵母对病原体进行生物控制的具体机制尚不完全清楚，尤其是它们对现有微生物群落的影响。

因此，本研究探讨了猕猴桃内生微生物组结构在酵母Debaryomyces hansenii的调节下对灰霉病的生物控制作用。采用宏基因组学方法分析了不同组别之间的内生微生物群落结构和功能。本研究通过鉴定猕猴桃不同微生物群落的群落结构变化和潜在功能差异，探讨了微生物群落结构与猕猴桃健康的关系。

1.健康和患病猕猴桃的微生物组组成

测定健康(CK)、灰霉病(HM)和接种D. hansenii/B. cinerea (JM)样品(图1A)。宏基因组测序从12个文库 (每种样品类型4个文库) 中共产生6799种细菌和256种真菌。NMDS排序和PERMANOVA分析表明CK、HM和JM样品的微生物群落结构存在显著差异(图1B)。各组间α-多样性对比分析显示，CK、HM和JM样品组间细菌群落结构Chao1丰富度指数无显著差异(图1C)。但与CK样本组相比，JM样本组Shannon多样性指数显著升高，HM组Shannon多样性指数升高，但未达到统计学意义。同样，在真菌群落结构内，JM样品组的Chao1丰富度指数显著高于CK样品组，而Shannon多样性指数显著低于CK样品组。

综上所述，该菌在猕猴桃组织中的存在和建立引起了细菌群落结构的微小变化，但不影响真菌群落的多样性。值得注意的是，生物防治酵母D. hansenii预处理增加了细菌群落的多样性，但也减少了真菌群落的多样性。

在细菌群落中，变形菌门、放线菌门和厚壁菌门在所有三个样本组(CK、HM和JM)中都是优势门，占各自群落丰度的≥99%。有趣的是，与CK样品组相比，JM和HM样品组显示变形菌门的相对丰度降低，同时放线菌门和厚壁菌门的相对丰度增加(图1D)。在真菌群落中，在所有三个样本组中，子囊菌门和担子菌门是门水平上的优势分类群，它们共同代表了≥99%的真菌丰度(图1D)。与CK样品组相比，JM和HM样品组真菌群落中子囊菌的相对丰度显著增加(图1D)。

单向方差分析(ANOVA)和Tukey-Kramer事后检验证实了样本组在差异丰度上的显著性。细菌群落中的放线菌和厚壁菌门在JM和HM样品组中表现出显著的富集(图1E)。正如预期的那样，由于JM样品组的伤口接种了D. hansenii，JM样品组的D. hansenii丰度显著高于CK和HM样品组。同样，B. cinerea的相对丰度与疾病严重程度一致，HM样本组的B. cinerea水平远高于CK和JM样本组(图1A)。这些结果提供了直接证据，证明相对于HM组，JM样品组显著抑制了B. cinerea。

图1 猕猴桃内生细菌和真菌群落组成。(A) D. hansenii对猕猴桃灰霉病发生抑制的代表性照片。三个处理组分别为:CK、HM、JM。(B) Bray-Cutis不相似矩阵与真菌和细菌群落的PERMANOVA的NMDS排序，显示样品组内有明显的聚类，样品组之间有明显的分离。(C)利用Chao1丰富度指数和Shannon多样性指数对3个样品组(CK、HM和JM)的细菌和真菌α多样性进行分析。(D)三个样本组中最流行的细菌和真菌门类的相对丰度。(E)三个样本组细菌和真菌组成的属级差异分析。

2.酵母菌显著影响猕猴桃微生物群共生网络

通过细菌与真菌界内共现网络分析，以及细菌与真菌界间共现网络结构分析，探讨接种B. cinerea和D. hansenii对猕猴桃内生微生物群落共生关系的影响。共现网络分析结果显示，细菌共现网络的节点和边的数量明显超过真菌共现网络的边缘和节点的数量(图2AB)。研究结果还表明，在细菌共现网络中，HM样品组比CK和JM样品组表现出更高比例的负相关，而JM样品组比CK和HM样品组表现出更高比例的正相关。值得注意的是，与CK和HM样本组相比，JM样本组在网络中显示出更多的模块化节点。此外，在细菌共发生网络中，具有最高节点度和接近中心性的两个中心节点在CK, JM和HM样本组中表现出最小的变化。这些节点代表变形菌门和放线菌门。相比之下，真菌界内共现网络中观察到截然不同的模式，CK、JM和HM样本组中前2个中心节点的节点度和接近中心度排名存在显著差异。更具体地说，在CK样品组中鉴定的淋巴结是担子菌门和子囊菌门，而在JM和HM样品组中，子囊菌门是优势门。同时，在JM、HM和CK样本组中，边缘之间观察到显著的正相关，相对于CK和HM样本组，JM样本组表现出更高程度的网络模块化。

图2 CK、HM和JM样品组猕猴桃内生微生物组的共现网络分析。节点(彩色圆圈)用颜色编码表示不同的细菌和真菌门(门的颜色编码出现在每组图的右侧)。节点大小反映节点复杂度，节点越大，度值越高。边缘线是彩色编码的;红色表示节点间正相关，绿色表示节点间负相关。

3.酵母菌影响猕猴桃内生微生物群的潜在功能方面

宏基因组数据的功能分析显示，CK、HM和JM样本组的KEGG功能谱存在显著差异，如PCoA图所示(图3A)。在KEGG第三功能通路水平对微生物群落的功能多样性进行分析，发现JM样品组的Shannon多样性指数最高(图3B)。主要类别，包括环境信息处理、遗传信息处理和细胞过程，在所有三个样本组中都被一致地识别出来(图3C)。

JM样品组中的变形菌门、子囊菌门和放线菌门对微生物群落的功能组成产生了重大影响。在HM和CK样品组中，功能特性的主要贡献者是变形菌门、放线菌门和厚壁菌门。值得注意的是，HM样品组中厚壁菌门的贡献高于CK样品组，这与我们之前陈述的结果一致(图3D)。

通过对功能基因丰度差异的分析，进一步了解B. cinerea和D. hansenii对猕猴桃内生微生物群潜在功能特性的影响。结果表明，HM样品组与具有抗菌活性的次生代谢物合成相关基因的相对丰度显著高于CK样品组。差异丰富的基因与次生代谢产物的生物合成(ko01110)、非核糖体肽结构(ko01054)、I型聚酮结构(ko01052)、次生胆汁酸生物合成(ko00121)、烯二醛类抗生素的生物合成(ko01059)、II型聚酮产物的生物合成(ko01057)、四环素生物合成(ko00253)、II型聚酮骨架的生物合成(ko01056)、各种次生代谢物的生物合成(ko00998)。相反，在JM样品组中，与这些途径相关的基因的相对丰度较低，这表明灰霉菌病的发病诱导微生物群落表达次生代谢物(图3E)。与CK样品组相比，JM样品组中与能量代谢和信号转导途径相关的基因的相对丰度显著增加。与富集基因相关的途径包括核糖体(Ko03010)、甘油磷脂代谢(Ko00564)、各种类型n -聚糖生物合成(Ko00513)、核糖体(Ko03010)、溶酶体(Ko04142)和磷脂酶D信号通路(Ko04072)。相反，HM样本组中与这些途径相关的基因的相对丰度较低(图3F)。此外，与HM和CK样品组相比，JM样品组微生物群落中与植物-微生物相互作用信号通路相关的功能基因的相对丰度更高。具体而言，参与调节植物生长和适应性的昼夜节律(Ko04710)通路在JM样品组中显著富集(图3F)。图3 基于宏基因组测序，在CK、HM和JM样品组中发现了不同的代谢途径。(A)基于KEGG三级注释的三个样本组的主成分分析。(B)三级路径的Shannon多样性指数。(C)类级别的KEGG功能。(D)柱状图说明属和功能贡献。(E, F) HM和JM的富集通路。

综上所述，灰霉病的发生和接种灰霉菌前应用生物防治酵母对猕猴桃内生微生物群落的结构和潜在功能都有显著影响。真菌群落对灰霉病和生物防治酵母的敏感性均远高于细菌群落。在接种灰霉病菌之前，在猕猴桃中施用生物防治酵母，可以增加猕猴桃真菌群落中有益酵母菌的数量，促进微生物群落的稳定，抑制灰霉病菌。引入酵母病原体也有可能吸引有益细菌，增强植物的抵抗力。本研究证明了生物防治酵母能够诱导猕猴桃内生菌群发生有益的变化，从而抑制灰霉菌，提高猕猴桃对灰霉病的抗性。本研究为进一步研究内生微生物作为可持续农业系统中促进植物健康的策略提供了基础。