南昌大学食品营养与健康创新团队JAFC最新研究：在生长期补充 3’-唾液乳糖可改善小鼠的学习和记忆发育

近日，南昌大学食品学院食品营养与健康创新团队的博士研究生朱柳颖、邓泽元教授、张兵研究员等人在国际期刊Journal of Agricultural and Food Chemistry发表了题为“Supplementation of 3'-Sialyllactose During the Growth Period Improves Learning and Memory Development in Mice”的文章。本研究表明，在小鼠生长期补充3'-Sialyllactose (3'-SL)可以通过促进大脑认知和记忆发展，首先，肠道菌群与小肠唾液酸酶协同作用，产生游离唾液酸，为大脑神经系统发育提供营养要素；其次，通过影响肠道菌群及其代谢产物的组成，间接促进大脑认知发育。此外，3'-SL诱导的聚唾液酸神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）可能与成纤维细胞生长因子受体（FGFR）和谷氨酸受体相互作用，激活MAPK信号通路和谷氨酸能突触，从而促进突触的生长和可塑性。该研究为3'-SL促进生长期小鼠认知发育的作用及其分子机制提供了新的思路。第一作者为2021级博士研究生朱柳颖，通讯作者为张兵研究员和邓泽元教授。

1. 3'-SL 能显著促进生长期小鼠认知和记忆功能；

2. 3'-SL诱导升高的PSA-NCAM可能与FGFR和谷氨酸受体相互作用, 促进突触的生长和可塑性，从而增强小鼠大脑认知发展；

3. 3'-SL对小鼠的认知促进作用受肠道微生物的影响，但不完全依赖于肠道菌群的存在。

生命的头两年是大脑发育的关键窗口，不仅对于神经细胞的快速增殖和生长，而且对于突触连接的增加也至关重要。因此，充足的生命早期营养对于确保婴儿和儿童的最佳认知发展至关重要。母乳含有独特的生物活性成分，通常被认为是婴儿营养的黄金标准。作为母乳中第三丰富的成分，母乳低聚糖（HMOs）被认为有助于胃肠道发育、大脑发育和预防致病事件。成熟母乳的 HMOs 含量为 3.5-14 g/L，其中50-70%的 HMOs 是岩藻糖基化的（即含有岩藻糖分子，中性HMO），其次是10-30%唾液酸化的 HMOs（即含有唾液酸 (SA) 分子，酸性HMO）， 大约 10% 的母乳OS 是中性HMOs，不含岩藻糖或 SA 。在酸性HMOs中，母乳中最丰富的 HMOs 是唾液酸乳糖（SL），它是由 SA 分子与乳糖结合而成的三糖分子。唾液酸乳糖含有 SA，可能会影响新生儿大脑发育。

SA是脑神经节苷脂和多聚唾液酸(PSA)的关键成分。神经细胞粘附分子 (NCAM) 是粘附分子免疫球蛋白超家族的成员，广泛表达于中枢神经系统细胞表面。它是脊椎动物细胞中 PSA的主要载体蛋白。脑神经节苷脂和多聚唾液酸化神经细胞粘附分子(PSA-NCAM)对于确保突触连接、记忆形成或神经元生长至关重要。SA可以从饮食中获得，也可以从头合成并掺入含有糖脂和糖蛋白的分子中。然而，人类新生儿合成 SA 的能力可能较低，无法满足对其作为 PSA-NCAM 和神经节苷脂的高需求，尤其是在早产儿中。因此，在早期神经发育过程中需要外源性膳食 SA 来实现最佳和快速的大脑生长。此外，与配方奶喂养的婴儿相比，母乳喂养的婴儿大脑中的神经节苷脂和蛋白结合 SA 水平更高。事实上，与配方奶喂养的婴儿相比，母乳喂养婴儿大脑中的 SA 浓度更高，这进一步表明生命早期需要 SA。

最近的研究强调了HMO对动物肠脑轴的影响，补充了它们作为益生元的作用。肠道微生物群对人类健康和疾病的影响是一个重要的医学问题，据信是通过肠脑微生物群通讯发生的。研究表明肠道微生物群与婴儿认知之间存在关联。HMO 作为一种益生元，可以被肠道微生物代谢和利用。结肠细菌表达多种酶，包括唾液酸酶，它们从唾液酸化寡糖中释放出游离 SA，随后作为细菌能量代谢的底物。然而，唾液酸酶不仅存在于结肠中肠道菌群和小肠中也存在3'-SL，尤其是在生命早期。研究表明小肠唾液酸酶活性在哺乳期最高，随着年龄增长而降低。但婴幼儿膳食唾液酸的代谢和吸收是否完全依赖于肠道菌群还有待进一步研究。

本研究旨在确定早期补充3'-SL在小鼠神经发育过程中的作用和作用机制。为此，我们给生长中的小鼠（3周龄）口服3'-SL，并在补充4周后进行行为测试以评估其认知记忆能力。我们分别通过16S rRNA测序和RNA测序评估3'-SL对小鼠肠道菌群和海马基因的影响。我们研究了肠道菌群在抗生素干预下介导3'-SL促进认知发育中的作用。最后，我们通过急性吸收实验探讨了3'-SL中唾液酸在小鼠中的吸收模式。

1、3'-SL 促进生长期小鼠的认知发展

如图1所示，行为学测试（包括Y迷宫，新物体识别和水迷宫）结果显示，3'-SL能显著促进小鼠认知和记忆功能。

2、3'-SL 对生长期小鼠肠道菌群的影响

如图2所示，3'-SL显著改变了小鼠肠道菌群的组成，显著地富集了Allobaculum（p<0.01）、Paraprevotella（p<0.05）和Lactobacillus（p<0.01），并显著降低了而Ruminococcus和Flexispira的相对丰度。

3、海马组织的RNA测序

为了更好的探究3'-SL促进小鼠认知发展的作用机制，我们对进行了3'-SL干预6周后的小鼠海马组织进行转录组测序分析。转录组测序结果显示，每组6个重复之间具有高度相似性，Pearson相关系数R2>0.95（图3A）。如图3B所示，与对照组相比，3'-SL组在643个基因中表现出差异表达（215个上调，429个下调）。

为了对基因功能进行更深入的分析，对对照组和3'-SL组之间的DEG进行GO和KEGG富集分析。如图3D所示， 在生物过程（BP）中，节律过程（rhythmic process, GO: 0048511）和G蛋白偶联嘌呤受体信号通路（G-protein coupled purinergic receptor signaling pathway, GO: 0035588）是显著富集的GO术语。在细胞成分 (CC) 中，最显著富集的 GO 术语是细胞外基质 (extracellular matrix, GO: 0031012)，以及突触后膜内在成分 (intrinsic component of postsynaptic membrane, GO: 0098936) 和突触膜内在成分 (intrinsic component of synaptic membrane, GO: 0099240) 等活动。在分子功能 (MF) 中，显着丰富的 GO 术语是嘌呤能受体活性(purinergic receptor activity, GO:0003735) 和近端启动子序列特异性 DNA 结合 (proximal promoter sequence-specific DNA binding, GO:0000987)，这些信号通路可能参与3'-SL促进小鼠认知记忆能力的作用机制。

在KEGG富集分析中（图4E），最显著富集的通路包括尼古丁成瘾、谷氨酸突触、Rap1信号通路、Wnt信号通路、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、神经活性配体-受体相互作用、MAPK信号通路、VEGF信号通路和长期增强。在谷氨酸突触（mmu04724）、神经活性配体-受体相互作用（mmu04080）、MAPK信号通路（mmu04010）和长期增强（mmu04720）中发现了与学习和记忆相关的信号通路。更重要的是，我们关联了唾液酸对大脑的影响，主要关注这四种信号通路，包括谷氨酸突触，MAPK信号通路和长期增强，并筛选出九个相关的DEG（NCAM，SCL17A5，ST8SIA4，Gria1，Gria2，Mapk1，Mapk3，FGFR2和FGFR1）进行进一步验证。

4、通过 QRT-PCR 验证选定的基因

从小鼠海马组织中筛选出9个DEG (NCAM、SCL17A5、ST8SIA4、Gria1、Gria2、Mapk1、Mapk3、FGFR2和FGFR1)，并采用QRT-PCR进行验证。如图4所示，3'-SL组海马中与认知能力相关的神经通路9个基因mRNA的相对表达量均显著增加，与转录组测序结果一致.

5、3'-SL对小鼠血清和海马组织唾液酸的影响

如图4G所示，3'-SL显著提高了血清中的Neu5Ac水平。此外，在海马组织中，与对照组相比，3'-SL显著提高了海马组织中与神经节苷脂结合的Neu5Ac水平（图4K，p<0.01）和蛋白质结合的Neu5Ac水平（图4L，p<0.001）。

6、抗生素干预不能消除3'-SL对小鼠认知记忆的促进作用

为了进一步研究肠道菌群在促进3'-SL诱导的小鼠认知发育中的作用，给小鼠口服混合抗生素以消除3'-SL诱导的肠道菌群效应（图5A）。MWM测试结果显示，在训练第五天，与CON组相比，3'-SL和3'-SL+AB组的平台潜伏期显著缩短（图5B，p<0.05），而CON+AB组没有显示出显著影响（图5B）。在没有平台的探索性试验中，补充3'-SL的小鼠表现优于CON组（图5D和E），抗生素干预并未消除3'-SL对小鼠长期和空间记忆的增强作用（图5D和E）。Y型迷宫实验结果如图5F和G所示，与CON组相比，3'-SL显著增加了小鼠在新臂中的运动时间和距离（p<0.001）。与CON+AB组相比，3'-SL+AB组在新臂中的运动时间和距离显著增加（p<0.01）。此外，与3'-SL组相比，3'-SL+AB组减少了小鼠在新臂中的运动时间和距离，但是无显著差异。在新物体识别测试中也观察到了类似的结果（图5H和I）。这些发现共同表明肠道菌群可能部分介导3'-SL对小鼠认知的影响，并且3'-SL促进认知发育并不完全依赖于肠道菌群。

7、抗生素干预对 3'-SL 治疗小鼠 Neu5Ac 水平的影响

随后分析了抗生素干预后小鼠血清和海马组织唾液酸水平的变化，如图6A所示，与CON相比，3'-SL组和3'-SL+AB组小鼠血清中Neu5Ac水平均显著升高（p<0.05），但3'-SL组的Neu5Ac水平高于3'-SL+AB组，尽管差异无统计学意义。在海马组织中（图 6B 和 C），与 CON 相比，3'-SL 显著增加了与神经节苷脂结合的 Neu5Ac 水平和与蛋白质结合的 Neu5Ac 水平。同样，与CON+AB相比，3'-SL+AB组小鼠海马中神经节苷脂结合的Neu5Ac水平和蛋白质结合的Neu5Ac水平均显著升高。然而，抗生素干预后，3'-SL+AB组小鼠海马中神经节苷脂结合和蛋白质结合的Neu5Ac水平低于3'-SL组，尽管差异无统计学意义。这些结果共同表明肠道菌群有助于唾液酸从饮食中释放，但这一过程并不完全依赖于肠道菌群。

8、3'-SL上的唾液酸可在上消化道快速水解和吸收

为了进一步验证3'-SL中的唾液酸是否在上消化道被水解释放，我们进行了3'-SL大鼠急性消化吸收实验（图7A）。如图7B所示，灌胃后5 min，血清中唾液酸水平开始上升，此时3'-SL仍在上消化道，说明上消化道中有唾液酸水解酶，负责水解3'-SL上的唾液酸，导致其释放和吸收。灌胃后15 min，3'-SL组大鼠血清中唾液酸水平明显升高，且随着时间的延长持续升高，在240 min时达到最高峰。随后小鼠血清中唾液酸水平开始下降，但仍然明显高于对照组。灌胃540 min后，取大鼠结肠内容物及海马组织，分析其Neu5Ac含量。如图7C所示，与对照组相比，3'-SL使海马组织中Neu5Ac含量升高，但差异无统计学意义。但在结肠内容物中，Neu5Ac含量显著升高（图7D，p<0.05）。

综上所述，本研究表明，在生长期补充3'-SL可以促进大脑认知和记忆发育。其作用机制涉及多个方面：首先，肠道菌群与小肠唾液酸酶的协同作用产生游离唾液酸，为大脑神经系统发育提供营养要素；其次，通过影响肠道菌群及其代谢产物的组成，间接促进大脑认知发育。此外，3'-SL诱导的PSA-NCAM升高可能与FGFR和谷氨酸受体相互作用，激活MAPK信号通路和谷氨酸能突触，从而促进突触的生长和可塑性。但这些信号通路的具体激活机制有待进一步研究。本研究结果为3'-SL促进生长期小鼠认知发育及其分子机制提供了新的思路。

朱柳颖 博士研究生

朱柳颖，营养与食品卫生学博士在读。以第一作者发表SCI论文7篇，主要研究方向为母乳低聚糖的功能活性及作用机理。

张兵 教授

张兵，博士、研究员/博导, 食品科学与资源挖掘全国重点实验室固定专家成员，中国营养学会海洋食品食品营养与健康分会委员，江西省营养学会理事，国家自然科学基金评审专家，教育部学位中心专业学位评审专家。主要从事新资源食品营养与健康、功能性食品开发领域的研究工作。近年来主持和参与完成国家自然科学基金6项，省部级项目8项，企业横向课题6项；申请国家发明专利11项，授权3项，在国外高水平期刊发表SCI学术论文80多篇，获江西省科技进步二等奖1项，江西省自然科学二等奖1项。

邓泽元 教授

邓泽元，二级教授，博士生导师。现任南昌大学食品科学与技术国家重点实验室副主任。享受国务院特殊津贴，赣鄱英才555工程人才、江西省新世纪百千万人才工程人选，江西省高校中青年学科带头人，首届江西省优秀硕士指导教师，江西省高等学校教学名师，获得教育部优秀中青年教师（支助），江西省主要学科学术与技术带头人，“食品科学”与“营养与食品卫生学”重点学科带头人。现任中国农学会微量元素与食物链分会副理事长，中国粮油学会营养分会副会长，中国营养学会营养转化医学分会副主任委员，江西省微量元素与健康研究会名誉理事长，江西省营养学会理事长；美国化学学会（ACS）会员、国际食品学会（IFT）会员，《食品科学》、《农产品加工学刊》、《食品安全质量检测学报》、《乳业科学与技术》、《南昌大学学报》（理科版）、J of Agri. Food Chem.和J of Food Biochem.编委，中国保健食品评审专家。