河北农业大学桑亚新教授:副干酪乳杆菌VL8与甘露寡糖联合通过调节肠干细胞位点修复DSS诱导结肠炎模型的肠道屏障

学术   2024-11-07 08:05   中国香港  
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Introduction

肠道的动态平衡主要依赖于肠道屏障的精心维护,肠道屏障是将宿主与有害的腔体微生物和化合物隔开的坚固的物理分界线。在这项研究中,研究了副干酪乳杆菌VL8和甘露寡糖(MOS)的共生组合在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型中潜在的肠屏障修复作用。为了全面了解控制肠道干细胞(ISCs)生态位的独特微生物过程,评估了一系列结肠屏障功能指标、肠道微生物区系组成和ISCs生态位的动态。本研究旨在为益生菌、合生素等微生态制剂领域的治疗和缓解涉及肠道屏障受损的胃肠道疾病提供新的见解,从而促进这些微生态制剂的治疗应用。


Results and Discussion

服用合生素可缓解DSS诱发的结肠炎
采用DSS诱导的小鼠结肠炎模型,评价VL8、MOS和合生素组合(SYN)对肠道屏障的影响。如图1b−d所示,DSS干预导致高疾病活动指数(DAI)评分和结肠缩短。此外,DSS诱导的远端结肠的严重病理改变的特征是广泛的上皮损伤、炎性浸润和结肠隐窝数量减少。AB-PAS染色显示DSS组黏液和杯状细胞减少。相反,VL8、MOS和SYN处理对结肠上皮显示了显著的保护作用,这从减轻DSS引起的病理损伤中得到了证明(图1e)。为了进一步评估炎症反应的变化,测量了结肠组织中炎症细胞因子的水平。与DSS组相比,VL8、MOS和SYN治疗组小鼠结肠组织中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、干扰素-γ和IL-6水平降低,而抗炎细胞因子IL-10水平升高。SYN组肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ和白介素6的蛋白表达水平被高度抑制,达到与对照组相似甚至更低的水平(图1f)。综上所述,这些结果表明,SYN治疗明显改善了DSS诱导的结肠炎。

图1  VL8、MOS及SYN干预对DSS诱导的结肠炎小鼠的影响

SYN给药恢复DSS诱导的肠屏障损伤
DSS组肝脏弥漫性肉眼苍白、脾变暗的形态学观察显示炎症扩散至肝脾,而VL8、MOS和SYN治疗组显著恢复肝脾颜色,降低肝指数(图2a)。用透射电子显微镜观察了不同组间紧密连接结构和绒毛的超微结构变化(图2a)。与VL8或MOS相比,SYN治疗在改善实验性结肠炎模型中结肠紧密连接和绒毛损伤方面显示出优势。随后,量化了结肠中紧密连接蛋白(occludin、claudin-1和ZO-1)的数量。图2b显示,与对照组相比,DSS组紧密连接蛋白水平显著降低。相比之下,SYN组这些紧密连接蛋白的水平显著升高,甚至超过了正常对照组。这些发现有力地表明,SYN治疗有效地改善了受损的肠道屏障,促进紧密连接蛋白的恢复到与健康对照组相当或超过观察到的水平。

图2  VL8、MOS和SYN干预对肠道屏障的影响

SYN可调节肠道干细胞生态位
SYN干预抑制了由DSS引起的不受控制的Wnt/β-catenin信号(图3a−c)。与DSS对照组相比,SYN显著下调Wnt和Lgr5蛋白的表达,这与β-catenin蛋白表达的降低和Wnt/β-catenin途径下游靶基因Cyclin的下调在转录水平上一致。这些发现表明,SYN抑制DSS诱导的Wnt/β连环蛋白通路的过度激活。

图3  SYN干预对肠道干细胞生态位的影响

SYN改变肠道微生物区系,提高乳杆菌水平
对盲肠内容物进行了16S rRNA基因测序,以探讨SYN是否改变了结肠炎小鼠的肠道微生物区系。PCoA揭示了不同组之间肠道微生物组成的不同。根据PC1(47.92%)和PC2(13.76%)的影响因素,将三组动物分为不同的聚类群,这表明了小鼠肠道微生物区系的差异(图4a)。以16S RNA基因测序为标志;与DSS组相比,SYN组的小鼠乳杆菌和鲁氏乳杆菌的丰度显著增加(图4c)。如图4e所示,LEfSe分析揭示了两组之间的显著差异。乳酸杆菌属是造成DSS组和SYN组之间差异的关键因素,这进一步证实了上述观察结果。根据这些分析,得出结论:SYN对肠道微生物组,尤其是乳酸杆菌属的影响很大。

图4  SYN干预对结肠炎小鼠肠道微生物区系组成和结构的影响

微生物组的改变调节色氨酸代谢
盲肠内容物中共鉴定出1770种代谢物。PCA分析显示DSS组和SYN组之间存在差异(图5a)。利用识别出的差异代谢物来生成代谢集,然后对它们进行途径浓缩分析,以探索代谢途径中的潜在变化(图5b)。值得注意的是,不同组之间的KEGG途径浓缩分析突出了色氨酸代谢途径,因为它在对所有代谢物进行KEGG途径分析时具有显著的活性(图5c)。根据参与色氨酸代谢的代谢物的代谢途径将其分为三类(表1)。在这里,将重点放在AhR途径上,涉及肠道微生物。如图5d所示,与DSS组相比,SYN处理增加了吲哚类化合物的相对丰度,尤其是3-吲哚乙酸。根据研究,来自肠道微生物区系的16种色氨酸代谢物,主要是吲哚类化合物具有AhR的激活潜力,因此对肠道AhR受体进行了免疫组织化学染色,以分析其在肠道中的表达。不足为奇的是,SYN治疗组AhR的表达含量显著高于DSS组(图5e)。因此,得出结论,SYN治疗调节结肠炎小鼠的色氨酸代谢,并刺激肠道中AhR的表达。

图5  SYN干预对结肠炎小鼠肠道内容物代谢谱的影响

表1  参与色氨酸代谢的代谢物


乳酸菌及其色氨酸代谢产物诱导肠道类器官分化的研究
从结肠内容物中收集LAB,并按照图6a所示的方法在添加色氨酸的培养基中培养,从而制备出肠道乳杆菌的色氨酸代谢物。同时,成功地从小鼠肠道中分离出肠道有机物质。与对照组相比,在实验室色氨酸代谢物干预后,萌芽类有机物的数量显著增加(图6b)。这表明实验室的色氨酸代谢产物促进了肠干细胞的分化。

图6  色氨酸代谢物的制备及其对肠道器官的影响

服用SYN的小鼠共居可减轻DSS引起的结肠炎
为了进一步证实肠道微生物群和代谢物在改善结肠炎症状中的作用。将施用了SYN的小鼠与施用了PBS的小鼠同群饲养,使两者的肠道微生物群或代谢物可以通过共食相互传播(图7a)。与施用SYN的小鼠同群饲养的小鼠结肠炎症状也有所缓解,这体现在DAI值(图7d)和促炎细胞因子水平(图7e)降低、结肠长度恢复(图7b)和炎症浸润减少(图7f)。结肠超微结构的评估和紧密连接蛋白的定量分析也表明肠道屏障得到了修复(图7f、g)。

图7  服用SYN的小鼠共居可减轻DSS引起的结肠炎

服用SYN的小鼠共居改变肠道微生物区系组成和色氨酸代谢
研究了共住对肠道微生物区系组成的影响。如图8a,b所示,结果显示,与SYN预干预小鼠共居的小鼠的肠道微生物组成与SYN组非常相似,但与DSS组小鼠有显著差异。在分析肠道微生物群落组成后,观察到SYN干预组和DS组小鼠肠道中拟杆菌门的丰度降低,而乳杆菌属的丰度增加(图8c,d)。此外,代谢组分析显示,与DSS组相比,DS组小鼠的代谢谱有显著差异(图8E)。

图8  共生剂量的小鼠共居改变肠道微生物区系组成和色氨酸代谢

Conclusion

总之,研究表明,益生菌副干酪乳杆菌VL8和益生菌甘露寡糖(MOS)的联合使用可以减轻DSS诱导的结肠炎小鼠的炎症并修复肠道屏障。这种有益的效果是通过调节肠道微生物区系及其代谢物来实现的。SYN干预促进了色氨酸的微生物代谢,直接或间接地调节了ISCs的生态位,促进了其向杯状细胞的分化,从而促进了结肠炎小鼠肠黏液屏障的修复。本研究的发现为益生元、SYN治疗肠道屏障功能受损的胃肠道疾病提供了新的视角,如IBD和IBS。然而,有必要进一步研究这种SYN在肠道免疫中的作用。此外,还需要更严格的实验设计来验证色氨酸代谢物在调节ISC增殖和分化中的作用。更好地了解损伤后组织再生和代谢反应的信号和介质对于开发临床相关的治疗干预措施至关重要。以各种方式调节ISC生态位以促进上皮再生成为抗击肠道疾病的一种新策略,有助于提供越来越多的证据表明肠道微生物区系和ISCs之间复杂的相互作用。



Synbiotic combination between Lactobacillus paracasei VL8 and mannan-oligosaccharide repairs the intestinal barrier in the dextran sulfate sodium-induced colitis model by regulating the intestinal stem cell niche

Tuo Zhang, Tiantian Cheng, Shuo Geng, Kemin Mao, Xiyu Li, Jie Gao, Jun Han, Yaxin Sang*

Department of Food Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding, Hebei CN 071000, China

*Corresponding author.


Abstract

Previously, Lactobacillus paracasei VL8, a lactobacillus strain isolated from the traditional Finnish fermented dairy product Viili, demonstrated immunomodulatory and antibacterial effects. The prebiotic mannan-oligosaccharide (MOS) further promoted its antibacterial activity and growth performance, holding promise for maintaining intestinal health. However, this has not been verified in vivo. In this study, we elucidated the process by which L. paracasei VL8 and its synbiotc combination (SYN) with MOS repair the intestinal barrier function in dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis mice. SYN surpasses VL8 or MOS alone in restoring goblet cells and improving the tight junction structure. Omics analysis on gut microbiota reveals SYN’s ability to restore Lactobacillus spp. abundance and promote tryptophan metabolism. SYN intervention also inhibits the DSS-induced hyperactivation of the Wnt/β-catenin pathway. Tryptophan metabolites from Lactobacillus induce intestinal organoid differentiation. Co-housing experiments confirm microbiota transferability, replicating intestinal barrier repair. In conclusion, our study highlights the potential therapeutic efficacy of the synbiotic combination of Lactobacillus paracasei VL8 and MOS in restoring the damaged intestinal barrier and offers new insights into the complex crosstalk between the gut microbiota and intestinal stem cells. 

Reference:

ZHANG T, CHENG T, GENG S, et al. Synbiotic combination between Lactobacillus paracasei VL8 and mannan-oligosaccharide repairs the intestinal barrier in the dextran sulfate sodium-induced colitis model by regulating the intestinal stem cell niche[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024, 72 (4), 2214-2228. DOI:10.1021/acs.jafc.3c08473.

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