南昌大学食品营养与健康创新团队：中国中部农村地区母乳寡糖谱的系统表征

近日，南昌大学食品学院食品营养与健康创新团队的博士研究生朱柳颖、邓泽元教授、张兵研究员等人在国际期刊Journal of Agricultural and Food Chemistry发表了题为“Systematic Characterization of the Oligosaccharide Profile of Human Milk in Rural Areas of Central China: Quantitative Tracking of Human Milk Oligosaccharide Composition during 12 Months of Lactation”的文章。本研究建立了一种快速、灵敏的检测方法，能够分析母乳中20种 HMOs 及其水解物LNT II的含量，并应用于中国中部3个农村地区在12个月哺乳期内采集的228 个母乳样本中的20种HMOs及其水解物LNT II的绝对定量。本文旨在描述 FUT2/FUT3 依赖型母乳群的 HMOs 轨迹，并监测中国部分农村地区人乳汁中20种HMOs及其水解物LNT II整个哺乳期（12个月）个体水平上的变化，并评估多种因素对HMOs浓度的影响，从而为中国母乳数据库的完善提供数据支持。第一作者为2021级博士研究生朱柳颖，通讯作者为张兵研究员和邓泽元教授。

1. 建立了一种快速、灵敏的HMOs检测方法

2. 比较了不同基因型母亲母乳中低聚糖的差异

3. 描述了不同泌乳期（12个月）HMOs的变化

4. 比较中国中部三个农村地区母亲母乳低聚糖的差异

5. 评估母亲因素（饮食、年龄、产次、BMI、分娩方式）和婴儿因素（身高、体重、头围和性别）在内的影响因素对HMOs浓度的影响

目前，市面上常用于强化儿科配方的低聚糖主要是低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides, GOS）和低聚果糖（fructo-oligosaccharides, FOS）。这两种低聚糖来源的结构和成分多样性都不如HMOs，通常用于模仿母乳中的益生元活性。因此，人们对寻找与HMOs结构相同或相似的低聚糖用于强化儿科配方表现出浓厚的兴趣。所以，为了更好地了解HMOs及其在婴儿配方奶粉中的应用，有必要研究其成分及其在哺乳期内浓度的变化。在过去的二三十年里，人们一直致力于HMOs的开发、特性和分析。然而，由于母乳中含有大量的脂肪和蛋白质，HMOs又是复杂的混合物，结构多样，包含多个同分异构体，且没有内在的发色团，使得HMOs的定性和定量检测都存在不小的难度。之前，HPLC与 UV、PAD联用通常用于 HMO 的定量。然而，未衍生化寡糖缺乏特定的紫外发色团，这意味着研究人员在使用紫外或荧光检测时选择衍生化以提高检测灵敏度。然而，复杂的样品前处理不仅耗时，并且可能会导致分析结果发生变化。相比之下，HPLC-MS方法由于其高灵敏度和便利的优势，被开发用于HMO的结构表征和分析。

个体间HMOs浓度差异很大，并且在很大程度上取决于母体遗传以及Se和 Le基因的等位基因变异，他们分别编码了FUT2和FUT3。根据FUT2和FUT3多态性，可以定义4个不同的母乳组。除了个体间差异外，个体内差异也很明显，因为HMOs的组成在整个哺乳期都会发生变化。在母乳喂养过程中，HMOs浓度从初乳中的20至25 g/L降至成熟乳中的5-20 g/L，并随着哺乳阶段、一天中的时间和母亲饮食而变化，以不断适应婴儿的需求。然而，目前仅少数研究在超过6个月的哺乳期并在个体水平上监测HMOs的变化。

目前，有越来越多的研究调查中国母亲的HMOs概况，但这些研究大多集中在城市地区，对农村地区的研究有限。因此，本研究建立了一种能快速、灵敏的检测母乳中20种HMOs及其水解物LNT II的方法，即采用 MRM 模式下的 LC-MS/MS 对中国中部3个农村地区在12个月哺乳期内采集的97 位母亲的 228个母乳样本中的20种HMOs及其水解物LNT II进行绝对定量，并通过Spearman相关性分析母亲因素（饮食、年龄、产次、BMI、分娩方式）和婴儿因素（身高、体重、头围和性别）在内的其他影响因素对HMOs浓度的影响。

1、分析方法

如表4所示，21种母乳低聚糖标准品在设定的质量浓度范围内呈良好的线性关系（R²＞0.995）。超高效液相色谱分析检测方法精密度良好，21种低聚糖成分重复进样分析的RSD均控制在10%以内。21种母乳低聚糖的添加回收率均在80％-120％之间，样品前处理方法的准确性用RSD值表示，且实验所得21种低聚糖的RSD值均小于10%。 

2、不同母乳组中HMOs

我们将所有母亲分为四组，以α-1,2和α-1,4特异性聚焦HMOs的存在和不存在为特征。如图1和2所示，2'-FL、LNFP-I ，LNDFH I和LDFT在母乳组1（FUT2+  FUT3+）和2（FUT2+ FUT3−）中显著富集，在其他母乳组中的浓度非常低（或低于定量限），其中2'-FL和LNFP-I的浓度在母乳组2中浓度最高，而LNDFH I和LDFT的浓度在母乳组1中浓度最高。LNDFH II和LNFP II，在母乳组3中浓度最高，其次是母乳组1，在泌乳早期，LNFP V，3-FL和DFLNH b在母乳组3中浓度高于母乳组4，但在泌乳后期，他们的浓度在母乳组4 中更高。LNnDFH在母乳组4中的浓度最高。LNnT和LNnH+p-LNnH在母乳组1和2中的浓度略高于母乳组3和4，反之，LNT在母乳组3和4中的浓度略高于母乳组1和2。唾液酸化母乳低聚糖（3'-SL，6'-SL，LST a和LST c）似乎不受母乳组类别的影响，只有在泌乳早期，母乳组3中LST b的浓度高于其他组。从总体来看，母乳组1和2中岩藻糖基化低聚糖和总低聚糖的浓度高于母乳组3和4，而唾液酸化母乳低聚糖和中心低聚糖在各牛奶组之间未见明显的含量差异。

为了进一步验证上述结果，我们对4个母乳组中20种母乳低聚糖进行了偏最小二乘回归分析（PLS-DA）。如图3所示，母乳组1与母乳组2重叠率较高，而母乳组3和母乳组4重叠率较高，说明该两个母乳组在低聚糖的含量和组成上差异较小。本研究选择VIP>1的差异低聚糖，探究不同母乳组中低聚糖含量上的差异，该结果与上述结果一致。

3、不同泌乳期HMOs

为了更好的描述母乳低聚糖含量在不同泌乳的变化，本节采用了30个母亲连续12月的母乳中低聚糖的含量数据。三个地区不同泌乳期低聚糖浓度变化如图4所示。对于岩藻糖基化低聚糖，2'-FL，LNFP I和LNFP V都随着泌乳期的延长，浓度逐渐降低，LNFP II， LNDFH I和DFLNH b在泌乳14d达到峰值，随后浓度开始下降；而3-FL，LDFT和LNDFH II的浓度随泌乳期延长逐渐上升，在泌乳期后期浓度趋于稳定。另外，LNnDFH似乎不受泌乳期变化的影响。

中性核心低聚糖如LNnT，LNnH+p-LNnH和LNT II的浓度在泌乳初期浓度最高，之后逐渐下降，LNT的浓度在泌乳14d达到峰值，随后浓度开始下降。LNnO在绝大多数母乳样品中未检出。

对于酸性低聚糖，除了3'-SL，所有酸性低聚糖（6'-SL，LST a，LST b和LST c）的浓度在泌乳初期最高，并随着泌乳期的延长，浓度逐渐降低。3'-SL的浓度在泌乳前期（5-180d）逐渐降低，但是在泌乳后期(180d-365d)，浓度反而上升了。从总体上，总酸性低聚糖，总岩藻糖基化低聚糖，总非岩藻糖基化低聚糖和总低聚糖的浓度均随泌乳期的延长逐渐降低，在泌乳后期（180d之后）趋于稳定。

为了进一步验证上述结果，进行了PLS-DA分析，并将将收集到的不同时期母乳分为四个阶段，分别为初乳（C）、过渡乳（TM）、成熟乳（MM）和晚期乳（LM），其中初乳为3/5d乳，过渡乳为14d乳，成熟乳为30/42d乳、6M乳和8/9M乳，晚期乳为12M乳。如图5所示，初乳和过渡乳中低聚糖的分布区域重叠率高，成熟乳和晚期乳中低聚糖的分布区域重叠率高，说明低聚糖浓度在不同泌乳期上存在较大差异。本研究选择VIP>1的差异低聚糖，探究不同泌乳期中低聚糖含量上的差异，且该结果与上述结果一致。

4、三个农村地区HMOs

三个地区在不同泌乳期中母乳低聚糖浓度变化如图4所示。三个农村地区母乳低聚糖的PLS-DA分析结果如图6所示，结果表明，兴国、浏阳和怀化地区母乳低聚糖分布区域重叠率高，说明三地区母乳中低聚糖的组成与含量相近。VIP值越大，该代谢物在三个地区的差异越显著。VIP值大于1的差异低聚糖有3-FL，LNFP I，LNT，LNDFH I，DFLNH，LDFT，2-FL。其中，HH地区中3-FL， LNT 和DFLNH含量高于其他两个地区，浏阳地区母乳中LDFT，2'-FL和LNDFH I含量较高，怀化地区母乳中LNFP I含量较高。

5、Spearman 相关性分析：与 HMO 特征相关的因素

（1） 母亲饮食对HMO 浓度的影响

哺乳期母亲摄入的膳食对各种HMOs的浓度的相关性如图7所示。母亲基因型的不同，膳食对HMOs的影响也不同。在非分泌型患者中（图7A），水果制品、禽肉、蛋及其制品和高盐类调味品分别与3'-SL、DFLNH、LNnH+p- LNnH和3-FL呈显著性正相关，而肉类和水产类加工品、高盐类调味品、非高盐类调味品、糖及其制品、植物油和动物油与部分岩藻糖基化低聚糖（2'-FL，LNFP II，LNFP V, LNDFH I和DFLNH）、中性核心低聚糖和酸性低聚糖均呈负相关。

在分泌型患者中（图7B）， 薯类，新鲜蔬菜，蔬菜贮藏加工制品，肉类和水产类加工品，乳及乳制品，坚果和植物油与部分岩藻糖基化低聚糖（2'-FL，LNFP I，LNFP II和LNDFH I）、中性核心低聚糖和酸性低聚糖均呈负相关，3-FL与多种膳食呈正相关，如薯类，豆类及其制品，新鲜蔬菜，肉类和水产类加工品，糖及糖制品和植物油。

（2）其他因素对HMO 浓度的影响

母亲年龄、孕前BMI、产次、分娩方式、婴儿性别，婴儿出生体重，身高和头围的变化与多种 HMO 相关（图8）。无论 Secretor 状态如何，母亲年龄和生产方式与低聚糖浓度没有无显著性相关性。在非分泌型患者中（图8A），胎次与LNFP II，LNFP V，LNT和6'-SL呈显著正相关，但是在分泌型患者中（图8B）胎次与低聚糖无显著性相关；母亲孕前BMI与分泌型患者的LNFP V，6'-SL和LST b呈显著性负相关，而LNDFH II呈显著正相关，同时与非分泌型患者的LST b也呈显著性负相关。婴儿出生体重和头围与分泌型患者的LNDFH I呈正相关，但是与非分泌型患者无显著性相关。婴儿出生身高与非分泌型患者的LNnDFH呈显著正相关，但是与分泌型母亲的低聚糖浓度无显著性相关。另外，在分泌型母亲中，与男婴母亲相比，女婴母亲的LNnH+p- LNnH浓度更高，但是在非分泌型母亲中，婴儿性别与低聚糖浓度无显著性相关。

综上所述，目前关于中国人群哺乳期 HMO 谱变化的研究较少，特别是在经济欠发达地区。本纵向研究通过对整个哺乳期来自中国中部农村地区的母亲进行密集抽样。本文系统分析了 20 种 HMOs及其酸水解物 LNT II，提供了它们在12个月哺乳期内的动态变化的详细报告。通过比较不同乳组之间寡糖的差异，探索了导致这些变化的内在因素。然而，为了全面了解地理、饮食和生活方式等其他影响因素，并比较城乡HMO之间的差异，还需要进行更广泛的研究。这应该涉及更大的样本量和更广泛地纳入来自中国各个地区的母亲。建立更为完善的中国母亲HMO数据库，将为指导个性化婴儿产品和精准营养的开发提供坚实的科学基础。

朱柳颖 博士研究生

朱柳颖，营养与食品卫生学博士在读。以第一作者发表SCI论文7篇，主要研究方向为母乳低聚糖的功能活性及作用机理。

张兵 教授

张兵，博士、研究员/博导, 食品科学与资源挖掘全国重点实验室固定专家成员，中国营养学会海洋食品食品营养与健康分会委员，江西省营养学会理事，国家自然科学基金评审专家，教育部学位中心专业学位评审专家。主要从事新资源食品营养与健康、功能性食品开发领域的研究工作。近年来主持和参与完成国家自然科学基金6项，省部级项目8项，企业横向课题6项；申请国家发明专利11项，授权3项，在国外高水平期刊发表SCI学术论文80多篇，获江西省科技进步二等奖1项，江西省自然科学二等奖1项。

邓泽元 教授

邓泽元，二级教授，博士生导师。现任南昌大学食品科学与技术国家重点实验室副主任。享受国务院特殊津贴，赣鄱英才555工程人才、江西省新世纪百千万人才工程人选，江西省高校中青年学科带头人，首届江西省优秀硕士指导教师，江西省高等学校教学名师，获得教育部优秀中青年教师（支助），江西省主要学科学术与技术带头人，“食品科学”与“营养与食品卫生学”重点学科带头人。现任中国农学会微量元素与食物链分会副理事长，中国粮油学会营养分会副会长，中国营养学会营养转化医学分会副主任委员，江西省微量元素与健康研究会名誉理事长，江西省营养学会理事长；美国化学学会（ACS）会员、国际食品学会（IFT）会员，《食品科学》、《农产品加工学刊》、《食品安全质量检测学报》、《乳业科学与技术》、《南昌大学学报》（理科版）、J of Agri. Food Chem.和J of Food Biochem.编委，中国保健食品评审专家。

天泽园