IF=23.7！浙江省农业科学院李有贵团队揭示桑黄多酚抗结肠炎肠道分子机制

肠道菌群—芳香烃受体（AhR）轴介导桑黄多酚抗结肠炎作用

iMeta主页：http://www.imeta.science

炎症性肠病（IBD）是一个重要的全球健康问题。肠道菌群在IBD的发生和发展中起着重要作用。桑黄是一种食药用真菌，具有良好的抗炎作用，并且能有效调节肠道菌群。尽管如此，桑黄确切的抗炎作用以及肠道菌群介导的机制仍不清楚。本研究证明了桑黄多酚（SH）通过调节肠道菌群有效减轻葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠的结肠炎病理症状。SH处理明显富集另枝菌属（Alistipes），尤其是Alistipes onderdonkii，及其代谢产物5-羟基吲哚-3-乙酸（5HIAA）。口服活菌A. onderdonkii或5HIAA可有效减轻DSS诱导的小鼠结肠炎。此外，5HIAA和SH均显著激活了芳香烃受体（AhR），而AhR拮抗剂消除了它们对结肠炎的保护作用。这些结果强调了SH通过促进A. onderdonkii和5HIAA的产生，最终激活AhR信号通路来减轻DSS诱导的结肠炎。这项研究揭示了基于SH和肠道菌群之间的相互作用开发结肠炎治疗策略的潜在途径。

引  言

炎症性肠病（IBD）主要包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），是一个全球性的健康问题，影响全球约0.5%人口。IBD的典型症状包括急性腹泻、间歇性腹痛、直肠出血和体重减轻。除了显著降低生活质量外，IBD还增加了结肠癌的患病风险，从而给个人和社会带来了沉重负担。目前，IBD缺乏明确的治疗药物，虽然常用临床药物具有较高的缓解率，但往往会出现继发性失败。因此，迫切需要寻找更有效、更安全的新的治疗干预措施。

越来越多的证据证明了肠道菌群失调与IBD 的发生发展内在联系。Machiels等人发现，UC患者肠道微生态失调表现为产丁酸盐物种，如Roseburia hominis和Faecalibacterium prausnitzii的显著减少。丁酸钠治疗可减轻结肠炎的炎症状态和肠黏膜病变。吲哚衍生物是重要的微生物代谢物，已被证实是改善实验性溃疡性结肠炎的有益药物。例如，吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚-3-甲醇（I3C）和吲哚-3-丙酮酸（IPA）可以作为芳基烃受体（AhR）的天然配体，通过提高血清和组织抗炎白细胞介素水平来减轻IBD。因此，肠道菌群及其代谢产物，特别是吲哚衍生物，可能是开发新的抗IBD治疗干预措施的有效途径。

中药（TCM）在中国已成功治疗疾病数千年。越来越多的证据强调了天然药物资源的药理益处。食药用食物已成为一种很有前途的疾病治疗方法。桑黄是一种可食用的药用真菌，可作为药物和膳食补充剂。研究证明，桑黄具有多种药理作用，包括抗炎、抗肿瘤和抗氧化。此外，它还具有调节肠道菌群的能力。然而，桑黄对于IBD的治疗潜力尚未被探索。本研究旨在确定桑黄多酚（SH）的抗结肠炎作用，并探讨其有益作用是否与肠道菌群密切相关，以及潜在的肠道分子机制。

本研究首先评估了SH抗结肠炎活性，并通过一种涉及体内功能验证和粪菌移植的综合方法证实了肠道菌群在其抗结肠炎作用中的重要贡献。此外，本研究还确定了关键的肠道细菌种类及其活性代谢产物5-羟基吲哚-3-乙酸（5HIAA），他们是SH改善结肠炎作用的关键介质，主要通过激活AhR信号通路发挥抗结肠炎作用。本研究不仅有助于更深入地了解SH的治疗潜力，而且也为今后探索SH和肠道菌群治疗结肠炎的治疗途径奠定了科学基础。

结  果

SH减轻DSS诱导的C57BL/6小鼠结肠炎

桑黄在中国已经实现了大规模的人工栽培（图S1A）。SH是桑黄多酚提取物（93.86% ± 2.78%）（图S1B；表S1)。本研究首先评价了SH在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠中的抗结肠炎作用（图1A）。与正常小鼠相比，结肠炎小鼠表现出体重减轻（图S2A)、疾病活动指数增加（DAI）（图1B)、结肠长度缩短（图1C；图S2B)、隐窝和结肠组织结构受损（图1D；图S2C)，以及明显的炎症反应（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和IL-17α增加，IL-4、IL-10和IL-22降低）（图S3)。低剂量和高剂量SH均可改善结肠炎病理症状，主要表现在增加体重，改善结肠长度和结构损伤（图1B-D；S2）。此外，SH给药以剂量依赖性方式逆转了炎症细胞因子水平的变化（图S3），表明SH具有强大的抗炎作用。

氧化应激和肠黏膜屏障对于维持肠道通透性以抵御毒素、致病菌和其他有害物质至关重要。我们在转录和翻译水平上评估了SH对上皮细胞紧密连接蛋白表达的影响，并检测了氧化应激相关基因的表达。与DSS组相比，SH处理组紧密连接蛋白基因Occludin、Claudin-3和Claudin-4的转录水平明显升高（图S4A），结肠组织中NF-kB、Nox4和Stat3的表达水平明显下调（图S4B）。同时，SH也增强了紧密连接蛋白的蛋白表达水平（图S4C-D），证实了SH对粘膜屏障的正向调控作用。此外，经过SH处理后，杯状细胞的数量也显著增加（图S4E）。以上结果表明，SH可显著改善DSS诱导的小鼠结肠炎症状。

图 1. SH缓解DSS小鼠实验性结肠炎症状，并改变其肠道菌群

（A）动物实验示意图；（B）疾病活动指数（DAI）评分；（C）结肠组织图片；（D）苏木精&伊红染色（H&E）结肠病理图（比例尺= 50µm）；（E）基于Chao1指数和Shannon指数评价肠道菌群Alpha多样性。（F）基于加权UniFrac距离的肠道菌群主坐标分析（PCoA）；（G）属水平上肠道微生物群的分类特征。（H）DSS相关细菌的核心微生物群。内环代表了在NC-DSS-SHL-SHH队列中可重复检测到的OTUs。不同微生物群落的相对丰度显示为蓝色（NC）、绿色（DSS）、红色（SHL）和青色（SHH）热图。alpha多样性分析采用Wilcoxon非参数检验，PCoA分析采用置换多元方差分析（PERMANOVA）。数据显示为平均值±标准误（n = 8）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。NC，阴性对照；DSS，葡聚糖硫酸钠；SHL，低剂量桑黄多酚组（250 mg/kg/d）；SHH，高剂量桑黄多酚（400 mg/kg/d）；DAI，疾病活动指数。

肠道菌群在SH抗结肠炎作用中起关键作用

为了评估肠道菌群对SH抗结肠炎作用的贡献，我们进行了16S rRNA基因测序分析，以评估SH治疗对肠道菌群的影响。DSS诱导结肠炎小鼠肠道菌群α-多样性明显低于正常小鼠（p < 0.05）。低剂量和高剂量SH处理均显著增加了α-多样性（p < 0.05，p < 0.01）（图1E）。主坐标分析（PCoA）和层次聚类分析显示，SH处理使肠道菌群向正常对照（NC）偏移（图1F-H）。这些结果表明，SH可以显著调节DSS诱导结肠炎小鼠肠道微生物群落。

为了进一步评估SH调节肠道菌群是否足以产生抗炎作用，我们使用含3% DSS处理小鼠，建立急性结肠炎小鼠模型，并将SH处理小鼠（供体）的粪便菌群移植到DSS诱导的结肠炎小鼠（受体）中（图2A）。由于结肠炎模型小鼠的粪便微生物群对结肠炎没有治疗作用（图S5），我们在随后的分析中没有进一步考虑这一点。与DSS小鼠相比，受体小鼠（DSS + SHfe）在体重、DAI评分、结肠长度和组织学方面均向正常趋势恢复（图2B-E；S6A-B）。粪菌移植还提高了血清IL-10和IL-22水平，降低了血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17α水平（图2F-H），表明其具有显著的抗炎作用。重要的是，SH调节的肠道菌群移植明显恢复了结肠炎小鼠的肠道屏障功能，这反映在Occludin, Claudin-2, Claudin-3 和Claudin-4 mRNAs和蛋白水平的上调（图2I；S6C）。因此，来自SH处理小鼠的肠道菌群表现出有效的结肠炎改善作用。

图2. 粪菌移植（FMT）揭示SH调节肠道菌群的抗结肠炎作用

（A）动物实验示意图；（B）小鼠体重（g）；（C）疾病活动指数（DAI）评分；（D）结肠长度（cm）；（E）苏木精&伊红染色（H&E）结肠病理切片（上）（比例尺= 200µm）和Claudin-4紧密连接蛋白免疫荧光图（下）（比例尺= 50µm）；（F）血清抗炎细胞因子IL-10 水平；（G）血清抗炎细胞因子IL-22 水平；（H）血清促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17α）水平；（I）结肠组织中Occludin，Claudin-3和Claudin-4的蛋白表达。采用单因素方差分析和Dunnett’s检验进行统计学分析。数据显示为平均值±标准误（n = 8）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。

SH富集Alistipes onderdonkii改善结肠炎

接下来，我们在属水平上仔细研究了肠道菌群的分类组成，以确定SH抗结肠炎作用的核心细菌。结果显示，与DSS组相比，对照组、SHL组和SHH组中，共有12个菌属表达上调，25个菌属表达下调（图S7A）。与对照组相比，模型组有34个菌属增加，13个属菌降低。低剂量SH处理使得10个菌属上调，4个菌属下调。高剂量SH处理后，20个菌属上调，4个菌属下调（图S7B）。差异表达分析显示，只有Alistipes在DSS组显著减少，而在SH治疗后显著增加（图S7C）。进一步Spearman相关分析表明，3个菌属与DAI评分显著负相关、与结肠长度显著正相关，其中Alistipes相关性最为显著（图S7D）。这些结果表明，SH可以显著调节肠道微生物群落，特异性富集Alistipes。

进一步，我们通过物种特异性定量PCR（qPCR）对粪便Alistipes进行定量，发现Alistipes onderdonkii是SH富集的主要菌种（图S7D-E）。我们获得了3株A. onderdonkii，并评价了它们对DSS诱导的结肠炎影响。结果显示，三个菌株中，两个A. onderdonkii 菌株（#1：FDB8和#2：FDFM）可有效预防体重减轻，降低DAI评分，恢复结肠组织损伤，改善炎症状态（图3A-E）。此外， A. onderdonkii提高了紧密连接蛋白的表达，以增强肠道屏障功能（图3F-H）。因此， A. onderdonkii可能是介导SH抗结肠炎作用的关键有效物种。有趣的是， A. onderdonkii（#3）几乎没有改善结肠炎，甚至造成了有害的影响（图S8），表现出了菌株特异性的功能。

图3. A. onderdonkii减轻DSS诱导的C57BL/6小鼠结肠炎

（A）小鼠体重百分比（%）和体重变化（g）；（B）DAI评分和DAI评分的AUC；（C）苏木精&伊红染色（H&E）的结肠病理切片（比例尺= 200µm）。（D）血清抗炎细胞因子IL-10和IL-22的水平；（E）血清促炎细胞因子IL-1β和MCP-1的水平；（F）结肠组织Occludin，Claudin-2，Claudin-3，Claudin-4和ZO-1的mRNA表达水平；（G）结肠组织Occludin、Claudin-3和Claudin-4的蛋白表达；（H）Claudin-4紧密连接蛋白免疫荧光图（比例尺= 50µm）。采用单因素方差分析和Dunnett’s检验进行统计学分析。数据显示为平均值±标准误（n = 8）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。

5-羟基吲哚-3-乙酸（5HIAA）是一种关键活性代谢产物

考虑到SH对肠道菌群的调节作用，我们对粪便样本进行了代谢组学分析，旨在识别功能微生物代谢产物。如图S9A所示，与NC小鼠相比，DSS诱导结肠炎小鼠中代谢物水平发生显著改变（图S9A），而SH处理组的代谢物谱与NC组接近，表明SH显著恢复了微生物代谢物的分布（图S9A）。随后，我们确定5HIAA在SH处理后显著升高（图S9B-C）。通过对3株A. onderdonkii功能基因序列的全面分析，发现2株A. onderdonkii（#1：FDB8和#2：FDFM）的基因组中含有一个与诱导吲哚化合物生物合成相关的tpl基因。相比之下，第三株菌株（#3：FDPA）的基因组缺乏这个特定的基因（图S9D）。为了证明A. onderdonkii确实具有产生5HIAA的能力，我们采用高效液相色谱（HPLC）对A. onderdonkii培养上清液中5HIAA含量进行检测，发现5HIAA浓度高达33.5 μg/mL。值得注意的是，5HIAA的产生与A. onderdonkii改善结肠炎的作用相关，主要表现为两个有效的A. onderdonkii菌株产生的5HIAA（33.5和16.83 μg/ml）多于无效菌株（0.83μg/ml）（图S9E)。代谢物与结肠炎指数的相关分析显示，有22种代谢物与结肠炎症状密切相关，其中5HIAA与结肠长度呈正相关，与DAI评分呈负相关（图S9F)。因此，SH可以促进5HIAA产生，这可能是与SH抗结肠炎作用相关的关键微生物代谢产物，尤其是A. onderdonkii。

据报道，肠道微生物产生的IAA可以缓解结肠炎。因此，我们研究了与IAA密切相关的衍生物5HIAA对DSS诱导结肠炎的影响（图4A）。IAA治疗显著改善了结肠炎的症状（图4B-F），这与之前的报道结果一致，而5HIAA在缓解结肠炎方面的表现明显优于IAA（图4B-F）。此外，这两种吲哚衍生物都能有效地提高抗炎因子的水平，降低促炎因子的水平，以减轻炎症反应（图S10A-B）。在DSS诱导小鼠中，吲哚衍生物也降低了氧化应激相关基因（NF-kB、Nox4和Stat3）的相对表达（图S10C）。此外，IAA和5HIAA均上调了紧密连接蛋白Occludin和Claudins的表达，后者具有显著性（图S10D-E）。

图4. 5HIAA治疗可减轻DSS诱导的C57BL/6小鼠结肠炎

（A）动物实验示意图；（B）体重百分比（%）；(C)小鼠DAI评分；（D）小鼠结肠长度（cm）；（E）苏木精&伊红染色（H&E）的结肠病理图（比例尺= 200µm）和小鼠组织学评分；（F）Claudin-4紧密连接蛋白免疫荧光图（比例尺= 50µm）。采用单因素方差分析和Dunnett’s检验进行统计学分析。数据显示为平均值±标准误（n = 8）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。IAA，吲哚-3-乙酸；5HIAA，5-羟基吲哚-3-乙酸。

结肠AhR激活对SH抗结肠炎具有重要作用

既往研究表明，微生物来源的吲哚衍生物可以通过结合并激活AhR来保护结肠炎，提示SH可能通过富集Alistipes及其代谢物5HIAA来激活AhR，从而改善结肠炎。为了证实这一假说，我们首先检测了AhR下游基因（Cypa1、Cypa2和Cypb1）在结肠中的表达水平。结果显示，5HIAA和SH两种处理均显著上调了Cypa1、Cypa2和Cypb1（图5A-B）基因水平，表明AhR在结肠组织中被激活。随后，我们用AhR抑制剂处理DSS小鼠，以验证AhR信号通路对SH抗结肠炎疗效的贡献。AhR拮抗剂StemRegenin 1基本上消除了5HIAA对结肠炎的改善作用，如体重、DAI、结肠长度、血清IL-22和IL-10水平，以及结肠组织病理学（图5C-H）。AhR拮抗剂消除了SH治疗对体重的有益作用（图5C-H），但对DAI、结肠长度等指标的消除作用明显减弱（图5C-H）。

通过对Caco-2细胞的体外实验，进一步验证了AhR信号通路的激活情况。CCK-8检测结果显示，五种浓度的5HIAA对Caco-2细胞都没有细胞毒性作用（图S11A）。虽然5-HIAA处理后Caco-2细胞中AhR的表达没有明显变化，但Cypa1、Cypa2和Cypb1的表达明显增加（图S11B），提示5HIAA部分激活了AhR信号通路。以上结果表明，SH至少大部分通过激活AhR信号通路来缓解结肠炎。

图5. AhR抑制剂可削弱SH和5HIAA的抗结肠炎作用

（A）5HIAA处理结肠炎小鼠结肠组织中Ahr、Cypa1、Cypa2和Cypb1的相对mRNA水平；（B）SH处理结肠炎小鼠结肠组织中Ahr、Cypa1、Cypa2和Cypb1的相对mRNA水平；（C-D）小鼠体重（C）及体重变化（D）；（E）DAI分数；（F）小鼠结肠长度（cm）；（G）血清抗炎细胞因子（IL-22和IL-10）水平；（H）结肠组织和苏木精&伊红染色（H&E）结肠病理图（比例尺= 200µm）。采用单因素方差分析和Dunnett’s检验进行统计学分析。数据显示为平均值±标准误（n = 8）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。AhR，芳香烃受体。

方  法

研究设计

本研究主要目的是评价桑黄多酚（SH）的抗炎作用，并探讨肠道菌群对SH抗结肠炎作用的贡献。采用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导实验性结肠炎，通过分析体重变化、结肠表型和组织学、炎症状态和结肠上皮屏障完整性来评估结肠炎症状。由于时间、成本和药物数量的限制，不同药物在慢性或急性结肠炎动物模型中进行了测试。据报道，在饮用水中使用1、2或3%的DSS会导致结肠炎，其中3%的DSS会导致最严重的结肠炎。因此，本研究采用1% DSS处理C57BL/6小鼠42天诱导慢性结肠炎模型，评估SH、5HIAA和IAA的抗肠炎效应；采用3% DSS处理C57BL/6小鼠10天诱导急性结肠炎模型，评估A. onderdonkii和AhR拮抗剂的作用。为了确定肠道菌群在缓解结肠炎中的作用，我们进行了粪菌移植（FMT）实验。具体而言，从SH处理的结肠炎小鼠（供体，n = 8）中收集粪便样品，制备成混悬液后灌胃给予另一组DSS诱导的结肠炎小鼠（受体，n = 8）。通过16S rRNA基因测序和相关分析，确定了SH对肠道菌群的调节作用，揭示了潜在的功能菌属/菌种。粪便代谢组学分析发现了肠道菌群来源的活性代谢产物。Spearman相关分析表明，5HIAA是关键代谢物，HPLC分析证实了A. onderdonkii（细菌）与5HIAA（代谢物）之间的联系。

为了验证A. onderdonkii和5HIAA的抗结肠炎作用，使用A. onderdonkii（北京量化健康科技有限公司提供）和5HIAA（购自阿拉丁）处理DSS诱导的结肠炎小鼠。由于5HIAA与IAA的密切关系，我们提出SH富集的5HIAA可以激活AhR信号，减轻肠道炎症，恢复肠上皮屏障，从而改善DSS诱导的结肠炎。为了验证这一假设，我们检测了5HIAA/SH组小鼠结肠组织中AhR下游基因的表达，证实5HIAA和SH对结肠AhR的激活。在DSS诱导小鼠中使用AhR抑制剂（AhRi）进一步证实了AhR的关键作用。详细信息请见补充材料。

动物实验

为了评估SH抗结肠炎作用，将小鼠分为4组，每组8只：NC组，给予等剂量蒸馏水；DSS组，在饮用水中每日补充DSS（1.0% w/v）；DSS + SHL和DSS + SHH组，DSS诱导结肠炎，并用不同剂量SH处理（250或400 mg/kg/天）。每3天测量一次体重，第42天评估疾病活动度指数（DAI）。实验结束时，小鼠禁食过夜，戊巴比妥钠麻醉，脱颈椎处死，收集全血、结肠组织、粪便样本。为了确定血清细胞因子水平，全血样本在4℃条件下以4000 rpm离心20 min，获得血清样本，并使用ELISA试剂盒（赛默飞世尔科技公司），按照制造商的说明进行分析。对A. onderdonkii，5HIAA和AhR的体内功效验证请见补充材料。

粪菌移植（FMT）

在DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型中，使用FMT评估了SH调节的肠道菌群的抗炎作用。供体小鼠使用含3.0%（w/v）DSS建立急性结肠炎模型。同时，供体小鼠每天灌胃SH（400 mg/kg）。从DSS+SH处理的第7天开始，每天收集每只供体小鼠的新鲜粪便样本。将来自经SH处理供体小鼠约2g新鲜粪便悬浮在20 mL蒸馏水中，通过多层纱布过滤，在4 ℃条件下以1000 rpm离心。用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.0）洗涤两次，然后在2 mL蒸馏水中重悬，获得粪菌悬液。24只雄性C57BL/6小鼠随机分为3组（n=8）：NC、DSS和DSS+SHfe组。所有小鼠在饮用水中给予青霉素（2000 U/mL）、诺氟沙星（3 mg/mL）和链霉素（2 mg/mL）混合物（Sigma Aldrich，美国），为期5天，以去除小鼠原有的肠道微生物。之后，NC组给予等剂量的蒸馏水，DSS和DSS+SHfe组在饮用水中补充3% DSS诱导急性结肠炎（3.0% w/v）。DSS组灌胃等剂量的蒸馏水，而DSS+SHfe组每天给予0.2 mL的粪菌悬液，连续处理9天。每日评估体重和DAI。在实验结束时，按照前述步骤收集血液和结肠组织。

16S rRNA基因测序

收集每只小鼠的粪便样本，液氮快速冷冻，随后-80 ℃保存。粪便DNA提取、PCR扩增和rRNA焦磷酸测序由杭州开泰生物技术有限公司（杭州，中国）完成。具体而言，扩增子文库的构建和测序利用了Illumina兼容的细菌PCR引物对319F/806R，该引物针对16S rRNA基因的V3 - V4区域。用E.Z.N. A.粪便DNA试剂盒（Omega生物技术公司）提取粪便DNA。PCR采用2×Phantamax master mix（Vazyme生物技术），热循环条件为95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环，最后在72 ℃延伸5 min。进行了3次重复的PCR（每个50μL），并在扩增后合并。测序前，PCR产物使用MiniElute Gel Extraction试剂盒（QIAGEN）提取，并以等摩尔浓度汇集，并使用Qubit（Invitrogen）测定文库的最终浓度。阴性DNA提取对照（裂解缓冲液和试剂盒试剂）也被扩增和测序，以监测污染。测序采用NovaSeq仪器（Illumina），使用PE250策略。

通过Vsearch v2.13.6质量控制过程对原始标签的质量进行过滤，以获得高质量的清洁标签。测序数据聚类采用Vsearch v2.13.6进行聚类，相似度水平设置为97%。基于RDP注释数据库（http://rdp.cme.msu.edu/），使用Mothur版本（1.42.1）软件的Classify.seqs命令来识别与OTU序列相似性最高的物种。使用Mothur版本（1.42.1）软件计算不同类群间物种多样性的动态变化。OTU丰度信息归一化为与序列数最少的样本对应的标准序列号。基于输出的归一化数据对alpha和beta多样性进行后续分析。使用R软件进行主坐标分析（PCoA），数据使用R包进行可视化。使用EasyAmplicon可视化核心细菌微生物组。一些细菌数据使用专门的可视化平台ImageGP进行可视化。

基因组组装

提取的DNA在Illumina HiSeq 2500平台上进行短读测序（150 bp对端），在齐碳(Qitan)纳米孔上进行长读测序。对于短读测序数据，使用具有默认参数的Fastp 对适配器进行裁剪。长读测序数据使用Porechop（https://github.com/rrwick/Porechop）进行适配器调整，并使用默认参数的NanoPack进行过滤。所有干净的序列都使用Unicycler组装。通过Proksee 进行基因组可视化。

统计分析

数据以平均值±标准误表示，并使用SPSS 17.0、Prism 7（GraphPad）、单因素方差分析（方差分析）和Dunnett检验进行分析，以评估组间药理参数的差异。p < 0.05。对宏基因组数据进行置换多元方差分析（PERMANOVA），评估主成分分析（PCA）和主坐标分析（PCoA）中组间差异的显著性。各组间的显著性差异采用Wilcoxon非参数检验。对于多次测试，使用Benjamini–Hochberg’s计算矫正的p值。p < 0.05。

讨  论

IBD构成了一个重大的全球公共卫生挑战。考虑到临床药物的不良反应和高复发率，探索干预和治疗IBD的新策略具有重要意义。令人信服的证据表明，肠道菌群及其代谢物与IBD 的发展之间存在复杂联系。此外，天然药物作为一个巨大的潜在资源库，由于其优异的有效性和安全性，以及对肠道微生物群的积极调节，为治疗IBD提供了有效的候选者。本研究证实了SH（桑黄多酚）的抗肠炎作用和对肠道菌群的调节作用。简单言之，SH富集的A. onderdonkii促进了微生物代谢物5HIAA的产生，它可以作为一种有效的配体激活AhR信号，从而显著改善DSS诱导的小鼠结肠炎。这种对微生物机制的理解丰富了我们对天然药物和肠道菌群之间相互作用的理解，促进对结肠炎新型治疗药物的开发。

尽管桑黄抗结肠炎作用已在多项研究中被报道，其潜在机制仍有待进一步阐明。值得注意的是，SH对结肠炎的有益作用尚未完全阐明。近年来，本研究团队对SH进行了系统的研究，包括全基因组测序。这些探索揭示了SH提取物中某些具有抗癌活性的成分。此外，我们的研究结果表明，桑黄菌丝体在仔猪的生长、免疫和粪便微生物群中起着调节作用。在本研究中，我们首次提供了强有力的证据，证实了SH具有强大的抗结肠炎疗效。值得注意的是，我们通过揭示肠道菌群在SH功效中的关键作用，向前迈出了重要的一步。利用粪菌移植（FMT）证明，与DSS处理的小鼠相比，SH调节的肠道菌群在改善结肠炎症状方面表现良好，包括改善体重、结肠长度、DAI、炎症状态和紧密连接蛋白。这些结果表明，SH可能是一种通过调节肠道菌群来治疗结肠炎的潜在药物。

在IBD复杂的环境中，人们普遍认为肠道菌群失调在其病因学中起着关键作用。值得注意的是，IBD患者和健康个体之间的细菌类群和群落多样性的改变已被报道。具体来说，IBD与某些条件致病菌丰度的增加有关，如肠杆菌科，以及抗炎菌属的丰度减少有关，如丁酸/丙酸产生者。本研究观察到DSS处理小鼠的微生物组成发生显著变化，并确定了三个关键菌属，即Alistipes、Alloprevotella和Clostridium XIVa，它们与结肠炎症状呈负相关。这些菌属是产生SCFA的细菌，被认为是结肠炎治疗中的有益微生物，这间接表明了这三个菌属的有益特性。其中，Alistipes是与结肠炎缓解最显著相关的菌属。关于相对较新的Rikenellaceae对结肠炎的影响，目前还存在争议。一些研究团队认为，Alistipes可以通过降解纤维素来增加小鼠对结肠炎的易感性，从而导致肠道免疫反应和肠上皮细胞的变化。Moschen等人之前报道A. finegoldii通过激活IL-6/STAT3信号通路促进结肠炎相关癌症的发展。然而，大多数研究倾向于将Alistipes作为一种具有减轻结肠炎作用的抗炎细菌。例如，Dziarski等人证明灌胃A. finegoldii有效地减轻了小鼠结肠炎。本研究中，Alistipes在实验性结肠炎小鼠中显著减少，但在SH处理的小鼠中显著增加。重要的是，我们获得了3株A. onderdonkii，使我们能够在菌株水平上对肠道菌群进行功能验证，这在之前的类似研究中并不常见。口服A. onderdonkii可有效预防DSS诱导的结肠炎，证实了Alistipes spp.对结肠炎的保护作用。值得注意的是，三株A. onderdonkii菌株中有一株几乎没有减轻结肠炎，表明菌株功能的特异性。事实上，菌株功能的特异性已经被越来越多的研究人员认识到，这强调了肠道菌群的药理作用应该涉及特定的菌株，而不仅是常见的细菌物种。这项工作中另一个有趣的发现是，在低（1%）和高（3%）浓度DSS处理下，其对肠道病理和肠道菌群的影响是相似的，这表明基于DSS的急性和慢性结肠炎模型具有统一的病理和肠道菌群结构。

吲哚衍生物是一种主要的肠道微生物代谢物，能有效改善结肠炎，并在结肠炎治理方面显示出巨大的潜力。我们发现，在SH治疗后，5HIAA显著增加，并与结肠炎的缓解呈正相关。此外，我们在两株有效的A. onderdonkii培养液中检测到相对较高的5HIAA，从而建立了活性代谢物和代谢物产生菌之间的联系。此外，吲哚及其衍生物被认为是AhR配体，而AhR是调节肠道免疫和激发下游级联的重要枢纽。越来越多的证据表明，AhR可以通过降低血清炎症细胞因子/趋化因子（如TNFα、IFN-γ、MCP-1和IL-17），增加IL-10和IL-22的表达，增强肠上皮细胞屏障来减轻结肠炎。因此，SH可能促进5HIAA的产生来激活AhR。与预期的一样，SH/5HIAA显著提高了结肠中AhR靶向基因的表达，表明AhR被明显激活。此外，AhR拮抗剂的使用表明，AhR信号在SH的抗结肠炎活性中起着至关重要的作用。值得注意的是，AhR拮抗剂消除了5HIAA对结肠炎的有益作用，而仅仅是减弱了SH的作用。考虑到这一差异，我们推测SH缓解结肠炎的能力可能与多种机制有关，因为SH中含有多种成分。例如，在之前的研究中，我们发现SH显著抑制IκBα，下调结肠凋亡相关斑点样蛋白（ASC3）和caspase-1的表达，表明NF-κB信号通路和NLRP3/caspase-1信号通路也可能参与SH的抗结肠炎作用。此外，桑黄菌丝体可上调kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）/核红细胞2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶-1（HO-1）通路，以减轻氧化应激，从而改善肠道损伤。需要强调的是，进一步的调查可以使人们能够全面了解SH其他潜在机制。然而，以上结果证实了我们关于“SH-Alistipes-5HIAA-AhR”调节轴的假说。

虽然我们的研究提供了坚实证据，表明肠道菌群及其代谢物5HIAA在SH的抗结肠炎作用中起着关键作用，但本研究仍存在一些不足之处。在我们实验中，SH是预防性地给予DSS诱导结肠炎小鼠。SH作为一种复杂提取物，可以隔离DSS，从而防止DSS诱导的结肠炎。因此，今后应评估SH的治疗效果，以消除SH可能通过与DSS直接相互作用来预防结肠炎的可能性。此外，SH还可能通过其他机制，如NF-κB和NLRP3/caspase-1信号通路，从而改善结肠炎。这一推测是基于以下事实：使用AhR拮抗剂处理大大消除了5HIAA对结肠炎的有益作用，但是SH的抗结肠炎疗效仅部分受损，说明5HIAA的富集并不是SH减少结肠炎的唯一途径。此外，5HIAA是由表达色氨酸酶的肠道微生物组发酵色氨酸产生的吲哚代谢物。这意味着多种细菌可能有产生5HIAA的能力。在这项工作中，我们发现了其中一种细菌A. onderdonkii可以产生5HIAA，这强调了肠道微生物可以通过产生吲哚衍生物，包括5HIAA和IAA，以此来缓解结肠炎。其他产生吲哚及其衍生物的细菌需要在未来的研究中进一步探索。此外，由于尚未进行定植评估、毒理学检测和进一步功能验证等一系列研究，我们所鉴定的肠道菌株A. onderdonkii是否可以进一步发展为产品尚不清楚。因此，需要进一步研究桑黄抗结肠炎作用及其作用机制，从而促进SH的开发和应用。