mRNA药物为何在肝脏非实质细胞中表现不佳？哪些细胞差异影响了mRNA的递送和翻译？

文摘 2025-01-19 19:00 上海

2025.01.19

本文字数：1996，阅读时长大约5分钟

导读：德国亚琛工业大学破解肝脏非实质细胞mRNA递送难题。研究发现，mRNA在NPC中翻译受限非因RNA - LNP摄取不足，而是受细胞生物学特性制约。肝细胞多倍体特性促mRNA表达，而NPC倍性特征致其总RNA和蛋白质数量不足，无法支撑mRNA药物翻译。

目前，全身注射的mRNA - LNP药物在治疗与肝脏实质细胞相关疾病方面效果显著，但对于靶向肝脏非实质细胞（NPC）却面临巨大挑战。尽管肌肉注射的mRNA疫苗能够有效激活肌肉组织中的免疫细胞，但全身注射要精准靶向肝NPC并非易事。

肝脏非实质细胞中的库普弗细胞（KC）和肝巨噬细胞是免疫反应的关键调节者，在耐受性调节和抗肿瘤免疫中发挥着极其重要的作用。然而，众多研究显示，mRNA在NPC中的递送和表达情况并不理想。因此，深入探究NPC中mRNA翻译所受的自然限制，对于开发靶向NPC的治疗策略至关重要。

2025年1月10日，德国亚琛工业大学联合多家医疗机构在Advanced Science上发表了题为“Exceptional Uptake, Limited Protein Expression: Liver Macrophages Lost in Translation of Synthetic mRNA”的研究论文。该研究采用递送siRNA、编码荧光蛋白（EGFP）的mRNA、荧光染料标记的EGFP mRNA或同时包封siRNA和mRNA的方式，借助活体显微镜（IVM）观察不同肝细胞对LNP的摄取情况，并从基础细胞学角度出发，分析肝实质细胞与非实质细胞之间存在哪些差异，进而影响mRNA的功能递送和表达。

LNP与mRNA均不是主要影响因素

研究团队首先对C57BL6J野生型小鼠进行静脉注射给药，剂量为2 mg/kg。经过16小时后，运用IVM技术开展体内活体成像实验，旨在探测EGFP的空间分布情况。结果出人意料，仅在肝实质细胞内发现了EGFP信号。而且，不同肝细胞的蛋白质翻译强度存在差异，较大肝细胞的信号强度明显高于较小肝细胞。更令人意外的是，在其他类型的肝细胞中均未发现明显的信号。通过体内对KC标志物F4/80进行染色，结果显示KC中并无EGFP表达（见图1B、C）。

图1. mRNA在不同肝细胞中的翻译效率

鉴于此现象，研究人员首先推测不同肝细胞对LNP的摄取效率差异是否导致了mRNA翻译的不同。他们利用qPCR技术，检测了EGFP mRNA在原代小鼠肝细胞、小鼠肝癌细胞系Hepa1-6、人宫颈癌细胞（HeLa）、小鼠L929成纤维细胞、人内皮细胞（EA.hy926）、小鼠J774.1巨噬细胞以及小鼠KC中的体外摄取状况。

实验结果显示，KC以及肝细胞和Hepa 1-6细胞内化了最多的LNP（见图2A）。流式细胞术和免疫印迹分析均证实，KC中EGFP的翻译水平极低，而肝细胞和Hepa 1-6细胞的蛋白质表达效率则位居前列（见图2B）。

在此研究基础上，团队进一步对具有巨噬细胞靶向性的LNP配方进行了测试。尽管巨噬细胞能够迅速摄取LNP，但并未发现EGFP表达水平有所提升。这说明，LNP的细胞类型特异性摄取并非是mRNA在NPC中翻译受限的原因。

图2. 不同肝细胞类型对mRNA-LNP的摄取

基于此，研究者们开始思考细胞内核糖核酸酶水平的差异是否会对mRNA的降解和表达产生影响。在人原代巨噬细胞实验中发现，LNP能够显著提高核糖核酸酶抑制剂1（Rnh1）的表达水平，但并未明显诱导核糖核酸酶的产生（见图2E）。而且，即便对核糖核酸酶1（Rnase1）进行敲低处理，EGFP信号也未受到影响，这说明LNP是否激活核糖核酸酶，并非是制约NPC中mRNA表达的关键因素。

研究团队还尝试通过更换LNP的可电离脂质或采用不同的mRNA修饰组合来改善情况，但结果表明，这些方法均未能有效提升mRNA在KC和巨噬细胞中的翻译效率（见图2F-H），从而证实LNP类型和mRNA修饰并非导致mRNA在NPC中表现欠佳的根源。

细胞倍性特征决定mRNA翻译效率

在深入探究肝细胞倍性特点的过程中，研究人员注意到，小鼠KC的倍性特征与人巨噬细胞存在细微差异。具体来说，小鼠KC通常仅含有一个细胞核，而肝细胞则呈现出明显的多倍体特征，其多倍体程度最高。为了验证肝细胞的多倍体特性是否对mRNA表达起到促进作用，研究人员在Hepa1-6细胞中采取了诱导措施，使其在有丝分裂早期阶段的细胞周期停滞，进而促使多倍体的形成。

通过流式细胞术对EGFP信号进行分析，结果显示，二倍体细胞中mRNA的翻译效率显著提高，那些翻译EGFP的细胞在大小和颗粒度方面也有所增加（见图3M）。

图3. mRNA蛋白质翻译和细胞倍性分析

研究人员分别从KC和多倍体肝细胞中提取了总RNA和蛋白质。研究发现，每个肝细胞所含的总RNA量约为21.8 pg，这一数值大约是每个KC所含RNA量的13倍。在蛋白质含量方面，每个肝细胞含有3 ng的总蛋白，这一数字比KC高出97倍（见图4A）。进一步的免疫印迹分析结果表明，关键的核糖体蛋白3（RPS3）在肝细胞中的含量也显著高于KC（见图4B）。

图4. 总RNA和蛋白质含量分析

这些研究结果揭示，基础的细胞差异以及肝实质细胞与NPC之间在倍性程度上的不同，是导致mRNA翻译效率存在差异的关键因素。

总结

本项研究指出，KC中mRNA翻译的缺失并非源于RNA - LNP摄取的不足，而是受到不同细胞生物学特性的限制。单个细胞类型的生物学特性在mRNA递送及后续翻译过程中所起的作用，可能远比之前认为的要重要得多，这颠覆了以往普遍认为递送效率是治疗效果关键因素的观点。

多倍体细胞具有更大的体积，拥有更多的染色体和基因拷贝数、更多的总RNA和蛋白质，这使得肝细胞在与肝脏其他细胞类型的竞争中占据优势地位。

无论是精心设计复杂的LNP制剂，还是研发其他类型的mRNA载体，都无法解决NPC缺乏mRNA翻译能力的问题。NPC的倍性特征决定了其每个细胞的总RNA和蛋白质数量不足以支撑所捕获mRNA药物的翻译。

深入了解肝脏生物学对于开发肝脏靶向RNA - LNP疗法极其关键。在设计具有更佳递送和表达效率的制剂之外，还需充分考虑细胞本身的特性，以研发出更有效的治疗药物。

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信息来源：RNAScript

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