环境介导的垂直传播促进了天牛与其共生体之间的非耦合系统发育关系
摘要
鞘翅目天牛科(长角甲虫)以物种特异的方式利用不同状态的木材(健康生长的、刚刚折断的、完全腐烂的等)作为幼虫的食物。一些天牛科群体的幼虫具有真菌囊,这是与中肠相关的附属器官,内含真菌共生细胞。这些共生细胞被认为能改善营养条件;然而,这一点尚未通过实验验证。为了推断这种共生关系的进化历史,我们调查了在日本收集的天牛幼虫的真菌囊特征。只有Lepturinae花天牛亚科、Necydalinae膜花天牛亚科和Spondylidinae椎天牛亚科这三个群体具有真菌囊,并且这三个群体的真菌囊及其对应的真菌细胞在特征上存在差异。然而,共生酵母的系统发育关系与相应的天牛物种的关系并不一致,表明它们并没有共同物种化。从雌性到后代的共生酵母不完全的垂直传播是一个可以解释宿主-共生体系统发育不一致的机制。一些Lepturinae花天牛亚科的物种在进化过程中第二次失去了真菌囊。这种丧失与它们的饮食选择有关,暗示不同的取食习惯可能使物种能够放弃这一器官。异养动物利用共生微生物来提高其营养物质的摄取。这种共生关系通常是互利共生,因为宿主动物为微生物提供了一个舒适的繁殖空间和必需的营养物质,而微生物则支持食物的消化并提供营养(Lindsay et al., 2020; Modolon et al., 2020)。通过共生,动物找到了适应不总是有利于生存的多变环境的方法。因此,共生系统对于理解动物在地球上的繁荣至关重要。在甲虫中,以木材为食的群体与真菌,特别是酵母菌,之间存在显著的关系(Vega and Blackwell, 2005; Gibson and Hunter, 2010; Hulcr et al., 2017; Biedermann and Vega, 2020)。许多酵母菌已从甲虫幼虫的排泄物、隧道和消化道中分离出来(Suh et al., 2005; Endoh et al., 2011; Davis et al., 2015)。在某些群体中,成虫具有特定的结构(真菌囊),用于储存真菌细胞,并在产卵时将其传递给下一代(Tanahashi et al., 2010; Joseph et al., 2021)。这些真菌在幼虫栖息的隧道中繁殖,并被纳入幼虫的消化道。这些真菌不仅作为幼虫饮食的一部分被消耗(Toki et al., 2012),还被认为有助于为幼虫创造适宜的条件,并协助木材的消化。确实,从鞘翅目幼虫中分离出的许多酵母具有纤维素、纤维二糖和木糖的消化活性(Davis et al., 2015)。天牛科(长角甲虫)是一个广泛分布的以木材为食的鞘翅目甲虫群体。天牛的幼虫在中肠前端附近具有一个独特的储存真菌的器官——真菌囊(mycetome)(Schomann, 1937;Nardon 和 Grenier, 1989;Grünwald et al., 2010)。真菌囊由一团球形囊泡组成,附着在肠道的外膜(浆膜)上。真菌囊内充满营养颗粒,主要由酵母组成的真菌共生细胞栖息在腔道或真菌细胞中(Jurzitza, 1960)。真菌细胞不断转移到肠腔中(Grünwald et al., 2010),并被认为有助于木材的消化。尽管真菌囊似乎对促进与真菌的共生至关重要,但其功能仍不明确。确实,真菌囊并不是所有长角甲虫(天牛)群体所共有的特征(Schomann, 1937)。因此,这一结构可能是在一些需要从共生真菌中获得额外益处以提高生存适应度的群体中获得的,例如通过真菌辅助发展高效的消化。然而,共生真菌对长角甲虫(天牛)所带来的优势仍需进一步研究。为了推断由真菌囊促进的共生的进化历史,我们研究了这种结构在日本不同亚科的长角甲虫(天牛)中的分布。我们检查了来自两个科、六个亚科、61个属、73个种和289个长角甲虫(天牛)个体的幼虫。包含真菌囊的物种中,Lepturinae花亚科的物种占主导地位;然而,一些Lepturinae物种并没有这种结构。我们发现,真菌囊的缺失与饮食选择相关。我们分析的具有或缺乏真菌囊的日本长角甲虫(天牛)群体/物种与之前关于欧洲物种中共生酵母存在/缺失的报告(Schomann, 1937)高度一致。Aegosoma sinicum中华裸角天牛属于Prioninae锯天牛亚科,其成员没有真菌囊。我们发现其幼虫与限量酵母物种(归类于Scheffersomyces属)表现出共生,这表明与酵母的共生早于在Cerambicydae天牛科进化过程中获得真菌囊。(A)日本天牛科/亚科的系统发育关系。红圈表示包含有真菌囊物种的组。所检查的物种数量在括号中显示。该系统发育树遵循Hadded等人(2018)的研究,尽管分支长度并不反映系统发育距离。(B)Lepturinae花天牛亚科 Caraphia lepturoides日本无瘤花天牛前中肠浆膜上的真菌囊(箭头)。前方朝上。比例尺,500微米。(C)Encyclops olivaceus榄色筒花天牛的真菌囊。比例尺,500微米。(D)Spondylidinae 椎天牛亚科Asemum striatum幽天牛的真菌囊。比例尺,500微米。该组的真菌囊形成两个环绕浆膜的环,由两个箭头表示。(E)Necydalis formosana台湾膜花天牛的巨型真菌囊(My)。比例尺,500微米。MG,中肠;Th,胸部。箭头指示连接真菌囊与浆膜的细管。(F)Lepturinae 花天牛亚科Paragaurotes doris娇拟金花天牛的无真菌囊中肠。比例尺,500微米。(G)Prioninae 锯天牛亚科Aegosoma sinicum中华裸角天牛的前中肠。比例尺,500微米。缺少真菌囊。
天牛幼虫的培养
我们的人工饲料是基于Gardiner(1970)的研究开发的。人工饲料Insecta FII(日本诺山公司)通过未公开的抗真菌化学物质防止真菌生长。将9克Insecta FII、6克死去的Symplocos coreana粉末和15克纤维素(ISC粉末)与以下液体揉合以制成ISC糊:30或45毫升水、30或45毫升溶解在水中的PDA,或30或45毫升与两种酵母之一(Candida vrieseae或Scheffersomyces sp. Y1052_SICYLG3)悬浮的1×PDA。这些酵母在PDA平板上培养,直到菌落生长覆盖培养液的表面。使用棉签收集菌落,并悬浮在PDA液体中,使液体变得混浊。我们没有对悬浮的酵母细胞进行定量。预计这些酵母能改善幼虫生长;然而,其效果值得怀疑,并未详细分析。ISC糊被涂抹在聚丙烯盒中,并在高压灭菌器中灭菌(105°C下20分钟)。将卵、孵化的幼虫或从死木中收集的幼虫放置在灭菌饲料上,并在室温下保存直到观察。为向幼虫引入选定的酵母,卵在灭菌的ISC糊上放置超过1天以进行灭菌。PDA培养基的粉末被悬浮在蒸馏水中,直至琼脂沉降。然后收集上清液以获得1 × PDA液体。将70 mm × 30 mm × 2 mm的Symplocos coreana矩形木板进行高压灭菌,然后涂抹上1 × PDA液体,酵母细胞以与ISC糊相同的方法悬浮在其中。灭菌的卵在涂抹了酵母的木板上进行培养,直至孵化。孵化出的幼虫被收集并在灭菌的ISC糊中培养约1个月,直到它们长得足够大以进行真菌体的外科隔离。
Fig. 2. Distribution of mycetomes in the subfamilies Lepturinae and Necydalinae. (A) This phylogenetic tree was generated by the maximum likelihood method based on the alignment of 28S rDNA sequences. Crossed circles indicate mycetome-lacking species. Open circles indicate Lepturinae species that preferentially include the yeast Scheffersomyces sp. Y1052_SICYLG3 in their mycetomes. Black circles indicate Lepturinae species that preferentially include the yeast Scheffersomyces ergatensis. Squares indicate Lepturinae species that preferentially include the yeast Candida vrieseae, with the information of their host trees. These three yeasts were frequently isolated from various species.
Note that for simplicity, this tree does not include all species examined in this study. The numbers beside branches indicate the percentage of times that a node was supported in 1000 bootstrap pseudoreplication. The scores that are equal to or exceed 50% are shown. Species names are based on Danilevsky (2020). The accession numbers of the DNA sequences used for the phylogenetic tree construction are shown at the right side of the species names. (B) A simplified image of (A), highlighting the distribution of the symbionts and the loss of mycetomes.
Fig. 7. Yeast-free mycetomes in Lepturinae larvae. (A) Leptura ochraceofasciata larvae cultured with an artificial diet. The images were obtained approximately 1 month after hatching. (B) Yeast-free mycetomes (knobs shown by the bracket). (C) A magnified image of the contents of yeast-free mycetomes. The inset shows the results of culturing of the contents on a PDA plate. No colony appeared. (D–I) The results for Stictoleptura dichroa. (D, E) Yeast-free mycetomes. (F, G) Yeast-poor mycetomes. Note that the color of the mycetomes is somewhat whitish. Four examples of yeast cells are shown by arrowheads. The yeast Meyerozyma caribbica was identified from the mycetomes. (H, I) Yeast-rich mycetomes. The yeast Scheffersomyces ergatensis was identified from these mycetomes.
许多以腐木为食的甲虫在其幼虫阶段依赖酵母或相关真菌(Davis, 2015)。尽管这种共生关系的作用尚未完全理解,但其推测的功能是提高从营养价值低于活植物的腐木中吸收营养的效率。天牛的幼虫,作为鞘翅目中最具多样化的群体之一,进化出一种特征性的贮藏真菌的器官——真菌腔,位于中肠(Schomann, 1936;Buchner, 1965)。在日本的六个天牛亚科中,Lepturinae、Necydalinae和Spondylidinae的物种具有真菌腔。作为天牛姐妹群的Disteniidae瘦天牛科中的日本物种则没有真菌腔,这确认了先前的报告(Svacha和Lawrence, 2014)。Svacha和Lawrence(2014)还报告称,Vesperidae暗天牛科和Oxypeltidae盾天牛科的幼虫没有真菌腔。由于缺乏真菌腔的科在天牛中占主导地位,因此真菌腔可能是在天牛的亚科中进化而来的。如果这一说法成立,那么根据天牛亚科的系统发育树,真菌腔至少在Spondylidinae和Lepturinae/Necydalinae中出现过两次(图1;Haddad等,2018;Nie等,2021)。Lepturinae和Necydalinae中真菌腔的出现可能是在这些群体根部的单一事件。在Lepturinae和Necydalinae中,真菌腔的出现可能是这两个类群的一个单一事件。这一观点得到了最近的系统发育研究的支持,该研究表明Necydalinae被包含在Lepturinae中(Nie等,2021)。然而,我们不能排除这些真菌腔独立进化的可能性,因为Necydalinae的真菌腔具有Lepturinae真菌腔中未见的特征。Necydalinae物种及E. olivaceus的共生菌是不可培养的,并完全占据了真菌腔的腔体。这些真菌腔和共生菌在Encyclops和Necydalinae物种之间的共享特征表明它们在系统发育上是相关的。先前的研究显示,Lepturinae物种Oxymirus cursor具有巨大的真菌腔,完全被细长的泪滴状和不可培养的共生真菌细胞占据(Buchner,1965)。这些描述的特征在Necydalinae中也相似。Necydalis与这些Lepturinae物种之间的系统发育关系应在未来的研究中加以考虑。在椎天牛亚科(Spondylidinae)和花/膜花天牛亚科(Lepturinae/Necydalinae)中,真菌囊(mycetomes)的出现表明,这一器官的获得对这些群体是有益的。这种共生关系的好处需要从共生体和天牛的各自角度进行考虑。通过真菌囊在天牛科(Cerambycidae)之间建立共生关系对真菌来说显然具有优势。我们的研究和之前的研究表明,某些物种的真菌囊中包含无法在PDA平板上增殖的真菌,尽管这样的平板对于许多酵母的生长是足够的(Müller, 1934)。由此可见,真菌囊的一个功能是为真菌提供其增殖所需的营养。此外,我们在此展示了,即使幼虫摄取含有抗真菌化学物质的人工饮食,Lepturinae的幼虫真菌囊中仍然存在酵母细胞,这些化学物质可以通过过夜培养使酵母细胞失活,这表明真菌囊的另一个作用是保护真菌免受可能存在于植物中或由竞争性真菌分泌的化学物质的影响。与Lepturinae物种的幼虫不同,N. formosana幼虫在以含有抗真菌化学物质的饮食培养时失去了其真菌囊中的共生体,这表明Lepturinae和Necydalinae的真菌囊在功能和结构上是不同的。在大多数情况下,单一的酵母菌种占据了幼虫的真菌囊,尽管幼虫有机会吸收外部酵母菌或自发存在于死树中的酵母样真菌。因此,真菌囊可以保护共生真菌免受其他真菌的竞争。与真菌的优势相对,天牛所获得的好处仍然不明。真菌囊是天牛衍生的器官,并且真菌并不是其形成所必需的这一事实暗示了与真菌的共生关系对天牛是有利的。有人提出,共生真菌对宿主甲虫在营养上是有益的,就像许多食木昆虫及其共生肠道微生物的情况一样(Gibson 和 Hunter,2010)。我们的研究提供了证据,表明共生关系与营养和/或取食习惯有关。本研究中检查的所有 Spondylidinae 物种以及大多数 Lepturinae 中具有真菌囊的物种都以褐腐木材为食。这种共同的食物选择是通过获得真菌囊实现的。一些 Lepturinae 物种没有真菌囊,而这一器官的丧失发生在几轮物种形成过程中(图 2)。失去真菌囊的现象与饮食选择密切相关。所有缺乏真菌囊的Lepturinae物种都以内皮或活根为食。内皮和活根的营养或生物条件与腐烂的心材不同。例如,内皮和活植物组织所含营养物质比心材更丰富(Schowalter, 1992)。饮食偏好的变化可能使Lepturinae物种能够摆脱真菌囊内的酵母菌,原因在于营养吸收的改善。当我们喂食人工饮食时,我们还发现拥有真菌囊的Lepturinae幼虫可以在没有共生酵母的情况下生长。为了进行这项实验,我们使用了一种基于蚕的人工饮食,其营养成分远比死木丰富。因此,在这种改善的营养条件下,拥有真菌囊的物种并不需要共生酵母,这在一定程度上支持了共生真菌的益处与营养相关的观点。为了更确凿地确认这一点,我们需要比较在低营养价值饮食下,拥有真菌囊的幼虫与没有酵母的真菌囊幼虫的生长速率。我们获得无酵母真菌囊幼虫的方法将有助于未来的实验。在天牛科(Cerambycidae)中,许多沟胫天牛亚科(Lamiinae)和天牛亚科(Cerambycinae)物种已知以新鲜死亡树木或活树的内皮为食(Svacha 和 Lawrence,2014)。Lamiinae 和 Cerambycinae 物种没有真菌囊,可能是因为它们的饮食比具有真菌囊的群体更具营养。Lamiinae 是 Spondylidinae 的姐妹群,而 Spondylidinae 在具有真菌囊的物种中占主导地位。与 Lamiinae 不同,日本的 Spondylidinae 依赖于褐腐木材(见补充表 S1)。这两个群体与真菌的共生策略在分化后可能在饮食选择上有所不同。我们必须注意,饮食选择的趋势并不总是得到支持,因为一些缺乏真菌囊的 Prioninae(如 Psephactus remiger)、Cerambycinae(如 Thranius variegatus、Paraclytus excultus、Xylotrechus cuneipennis)和 Lamiinae(如 Nanohammus rufescens)物种以强腐木或外皮为食。这些物种可能有其他方式来增强其营养状况,包括与另一微生物群体(如细菌)建立共生关系,正如之前所报道的那样(Grünwald et al.,2010;Reid et al.,2011)。在我们的实验中,缺乏真菌囊的天牛幼虫的肠道中通常没有酵母,而拥有真菌囊的幼虫则有(见表1),这表明许多缺乏真菌囊的物种在代际之间并不转移酵母。当在这些幼虫中发现酵母时,酵母种类通常在个体之间有所不同。一种可能的解释是,缺乏真菌囊的幼虫从环境中获取酵母,能够耐受幼虫消化系统的酵母种类在肠道中繁殖。这种依赖环境的酵母获取方式可能是天牛与酵母之间共生关系的祖先形式,正如之前所提到的(Douglas, 1989),而在拥有真菌囊的物种中观察到的酵母外部传递很可能是这种祖先共生关系的残余。由于缺乏真菌囊的天牛A. sinicum可以在代际之间共享有限数量的酵母种类,因此真菌囊的出现并不是天牛与特定酵母开始共生所必需的。由于拥有真菌囊的天牛往往倾向于选择单一的酵母或真菌物种/群体作为其共生伴侣,真菌囊可能会将共生体限制为特定物种。这种真菌囊的作用应与雌性生殖器中储存共生酵母的囊的发育相辅相成(Schomann, 1937;Buchner, 1965)。借助于垂直传播机制,真菌囊和共生体具有群体特异性特征。Lepturinae亚科的幼虫倾向于在PDA平板上培养酵母,而酵母细胞并未完全占据真菌囊叶的腔道。Spondylidinae亚科的幼虫则具有无法在PDA平板上培养的细长酵母。Necydalinae亚科的幼虫拥有比Lepturinae中的酵母细胞更大的无法培养的真菌细胞。Necydalinae的真菌囊发育良好,其腔道完全被真菌细胞占据。这些群体特异性特征的存在表明,即使在这些群体内发生物种分化,一些限制因素也在发挥作用,以防止这些特征的丧失。可能这种限制与群体特异性的饮食选择有关。这些群体特异性的饮食选择包括腐木的硬度/软度和湿度程度,以及对特定真菌侵染的依赖(Svacha和Lawrence, 2014)。然而,我们的数据表明,伴生菌在代际之间的垂直传播并不完美,幼虫有时携带与伴生菌种类不同的酵母。这些例外可以用酵母在代际之间传播的不完全性来解释。此外,这种偶然的“错配”可能会扰乱伴生酵母与天牛种类之间的系统发育关系。在天牛的物种形成过程中,从环境中获取伴生真菌促进了伴生酵母种类的多样化,这种多样化并不总是与天牛的物种形成相关。我们发现,使用山茶科植物作为宿主的Lepturinae物种主要具有与Candida vrieseae相关的伴生酵母,尽管这些Lepturinae物种并不是单系的。可能是因为使用同一棵枯死的树木促进了不同甲虫物种之间酵母种类的共享。宿主甲虫物种与伴生酵母之间的系统发育错配在锹甲中也有报道(Kubota et al., 2020),这表明这种不一致的进化在鞘翅目群体中是普遍存在的。这种不一致的进化可能是因为伴生酵母具有相似的生理特征,并且酵母的功能可能是提供非必需的饮食补充,当天牛将食物从枯木切换到内皮时,这种补充可能变得可有可无。