研究背景
临界尺寸骨缺损是医学领域的难题。传统治疗方式中，自体骨和异体骨因供体稀少、替代骨与损伤区域的大小不匹配及免疫排斥等问题，难以广泛应用。骨组织工程通过细胞与生物材料的结合为上述问题的解决提供了新的解决方案。脂肪源干细胞（ADSCs）因其获取便捷、成骨分化潜能强的特性成为骨再生研究的热点。直接注射ADSCs，存活时间短，将其与支架材料结合可显著提高体内保留率和骨再生性能。通过3D打印等技术制备支架，模拟骨的多级结构，是一种促进骨再生较为有效的方法。化学信号如生长因子与支架的物理特性结合，同样可增强ADSCs的成骨分化。尽管如此，已有研究在模拟骨组织的多级结构上仍存在局限性，需进一步优化支架结构及组合，以提高骨缺损的治疗效果。
关键词：脂肪干细胞，静电纺丝，复合纤维，骨再生
本研究通过静电纺丝技术制备了包含聚己内酯（PCL）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和纳米羟基磷灰石（HAp）的复合纤维膜。该纤维膜响应孵育条件后卷曲，形成模拟骨单位的三维管状结构。针状HAp纳米颗粒均匀分布在纤维基质中，且不影响纤维的表面形貌。通过控制纤维膜的初始形状和尺寸，获得了单层（SPLG80-H和SPLG85-H）和多层的管状单元（BPLG-H(1.5)和BPLG-H(3.5)）。在多层管状单元的凹面上，rADSCs显著上调VEGF和BMP-2的表达水平，增殖更快且成骨活性更高。体内实验表明，将负载rADSCs的多层管状单元植入大鼠颅骨缺损后，骨再生效果显著优于对照组，为临床骨缺损修复提供了一种新策略。
本文要点
要点1
BLCMs的制备与表征
如图1所示，所制备的纳米HAp呈针状结构，其平均直径为57±39 nm，长度390±208 nm，且纯度较高，不含杂质。静电纺丝过程中HAp被包裹于纤维内部，未影响纤维原有形态。所制备的单层（SL）纤维膜具有良好的皱缩性能，且SPLG85-H、SPLG85的皱缩效果更强烈；HAp的加入对单层膜的皱缩性质无明显影响。此外，SPLG85-H与SPLG85皱缩后的厚度增加更显著。
图1 HAp表征以及有无HAp的SL纤维膜的表征。(a) HAp的SEM和TEM图像；(b) HAp的XRD图（红线表示PDF卡片No.9-432中HAp标准品的峰）；(c) 有无HAp的电纺纳米纤维的TEM和SEM图像；(d) 具有不同组分的电纺纤维膜的皱缩率和皱缩后的厚度（n = 3）；(e) SL纤维膜皱缩前后的面积和厚度的变化示意图（膜保持平整；绿色、浅蓝色和深蓝色分别代表PLG80-H层、明胶层和PLG85-H层）
将包埋HAp的双层复合纤维膜（BLCMs）切割为一定形状的结构单元后，该结构单元可响应孵育条件形变为3D管状结构。如图2所示，为了使BLCMs达到最佳卷曲结构，优化纺丝参数，对双层膜的纺丝比例和总厚度进行调控；证实当双层比例为1/2，总厚度为2.5 μm时，得到的3D结构最立体化。此外，综合考虑卷曲后的尺寸和卷曲率后，证实经激光切割成的等腰三角形（顶角30°，腰长1.5 mm）纤维膜，卷曲后可获得最小的管状单元。
图2 为获得最小的3D管状单元和卷度比，优化BLCMs制备参数。(a) 总厚度相同而纺丝比例不同，与比例相同而总厚度不同的BLCMs皱缩后的光学显微镜图像以及 (b) 相应卷度比和直径；(c) 不同顶角角度和腰长的BLCMs卷曲后的光镜图像以及 (d) 相应卷曲比和投影面积；(e) BPLG-H(3.5) 和BPLG-H(1.5) 的OCT截面图；(f) BLCMs形变过程示意图（红色箭头表示明胶溶解方向；深蓝色、绿色和浅蓝色分别代表PLG85-H、PLG80-H和明胶层）
如图3的SEM结果所示，皱缩后纤维形态出现不同程度的弯曲。经过28天的体外降解实验，BLCMs的3D结构完整，且PCL与HAp的结晶峰仍存在，这有利于维持细胞黏附与增殖微环境的稳定。
图3 BLCMs的体外降解性能。(a) BLCMs在PBS溶液（pH = 7.4，37°C）体外降解28天后的SEM图像，“After-deform”表示形变后，“After-degra”表示体外降解后；(b) 未处理、形变后及降解后BLCMs的纤维平整直径，“As-spun”表示未处理；(c) 未处理、形变后及降解后BLCMs的XRD图
要点2
rADSCs在BLCMs上的增殖与成骨分化性能
体外探究了BLCMs的生物相容性以及3D管状单元宏观尺寸对rADSCs增殖的影响。如图4所示，接种于BPLG85-H面（凹面）的细胞活力显著高于粘附在BPLG80-H面（凸面）的，且纤维膜曲率越大，细胞数量越多。BPLG85-H(3.5)组表现出优异的促rADSCs增殖和VEGF分泌性能；此外，体外成骨诱导分化结果也表明，BPLG85-H(3.5)组的成骨效果最佳，能够形成大量钙化基质。
图4 rADSCs在BLCMs上的增殖和成骨分化行为。(a) 细胞在增殖培养基中孵育，并进行CCK8检测；第7天，用ELISA法定量测定培养基中 (b) VEGF和 (c) BMP-2的浓度；(d) 成骨诱导21 天茜素红染色后的光镜图像；(e) DAPI染色后CLSM图像的三维重建；(f) 茜素红染色后的定量结果；第21天成骨培养基中 (g) VEGF和 (h) BMP-2的浓度（n = 3，与TCP组比较，*p < 0.05）。
后续进一步探究了rADSCs在不同纤维膜及不同孵育条件下的成骨分化性能。如图5所示，无成骨诱导因子时，纤维膜的卷曲和HAp的掺入可联合促进rADSCs的成骨细胞，上调VEGF与BMP-2的表达。成骨诱导因子与BPLG85-H(3.5)的组成、微宏观形貌协同作用，使得BPLG85-H(3.5)表现出最佳的诱导成骨分化能力。将rADSCs以较低的密度接种于纤维膜上，先进行增殖培养后进行成骨分化诱导的结果也表明，BPLG85-H(3.5)具有出色的促细胞增殖和成骨分化特性。
图5 不同培养条件下BLCMs对rADSCs的成骨分化的影响。(a) 增殖培养基培养8d，(b) 成骨培养基培养8d以及 (c) 先增殖培养基培养10d，后转入成骨培养基培养8d后样品的茜素红染色光镜图像；(d) 茜素红染色的定量结果；不同培养条件下培养基中 (e) VEGF和 (f) BMP-2的浓度（n = 3，与当天相同形状和尺寸的纤维膜组比较，*p < 0.05）
要点3
负载rADSCs的BLCMs促进大鼠颅骨缺损再生
如图6所示，负载rADSCs的BLCMs有效促进了大鼠颅骨缺损区域血管的生成和新骨的形成。同时，HE染色和Masson染色结果证实了纤维膜在大鼠体内具有良好的可降解性。相较于Blank组与BHM组，ADSC@BHM组的新骨形成量明显增多，这表明rADSCs与BLCMs的结合能够协同促进大鼠颅骨缺损的修复，具有优异的促骨再生性能。
图6 植入载rADSCs的BLCMs 12周后，临界尺寸颅骨缺损的体内骨再生结果。(a) Blank、BHM和ADSC@BHM组的光镜图像和micro-CT三维重建图像（红色虚线圈代表初始颅骨缺损）；(b) 每一组的BV/TV结果（BV，新生骨覆盖体积；TV，初始颅骨缺损体积；n = 3，与空白组相比，*p < 0.05）；(c) Blank、BHM和ADSC@BHM组骨组织的HE和 (d) Masson染色图（NB，新骨；CT，结缔组织；B，宿主骨）
通过静电纺丝技术制备了基于BLCMs的3D纳米纤维支架，该支架良好地模拟了骨单元多级结构与组成，为rADSCs促进骨再生构建了适宜的微环境。该3D纤维支架具有微米级曲面及纳米级纤维，且纤维基质中HAp的掺杂进一步丰富了物理信号，上调了VEGF和BMP-2的表达，促进了rADSCs的体外增殖和成骨分化。植入大鼠临界尺寸颅骨缺损后，负载rADSCs的3D纳米纤维支架（ADSC@BHM）表现出远优于空白组的骨再生能力。总之，ADSC@BHM在治疗骨缺损领域具有优良潜力。此外，本研究阐明了3D纤维结构与VEGF、BMP-2的表达、rADSC增殖与成骨分化的潜在联系。后续研究拟进一步探究纤维膜与其负载的ADSCs促进骨再生的机制。
本研究得到了深圳市自然科学基金项目（JCYJ20190807155805818）的支持。
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作者简介
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江华敏
共同第一作者
硕士研究生，就读于中山大学生物医学工程学院，导师是李燕副教授，主要研究方向为骨修复材料。
林钊溢
共同第一作者
硕士研究生，就读于中山大学生物医学工程学院，导师是李燕副教授，主要研究方向为纤维膜折纸技术在骨修复领域中的应用研究。
李 燕
通讯作者
中山大学生物医学工程学院副教授，硕士生导师，2019年度广州市珠江科技新星，主要研究方向为生物医用复合材料，包括电纺纳米纤维、水凝胶支架等，诱导脂肪干细胞增殖与分化，促进组织修复。主持及参与国家省市科研项目10余项；共发表SCI论文40余篇，以第一/通讯作者在中科院大类一区杂志如Chemical Engineering Journal等发表SCI论文20余篇；共申请国家发明专利10余项，授权9项。担任Frontiers in Bioengineering and Biotechnology专刊客座主编，以及多个期刊如Advanced Functional Materials、Aggregate等的审稿人。
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观点 || 用于稳定、长期采集脑电信号和肌电信号的离子凝胶和共晶凝胶（香港科技大学化学及生物工程系邢怡铭、Nyein团队）
期刊特色｜Unique Features
01
免费开放获取，免除作者出版费
02
快速发表，文章被接收后24h内上线
03
“未来展望”，展示该研究领域前瞻性专家观点
04
自由格式撰写，排版工作由IOPP承担
期 刊 简 介
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Materials Futures（《材料展望》， ISSN 2752-5724）创刊于2022年，由松山湖材料实验室与英国物理学会出版社（IOPP）联合出版，入选“2022年度中国科技期刊卓越行动计划高起点新刊”、“2023年度广东省高起点英文新刊项目”，2023年3月成为国际出版伦理委员会 (COPE) 成员，现已被ESCI、Ei、Scopus、Inspec、DOAJ、万方等数据库收录。获得首个影响因子12.0，在全球材料综合类438本期刊中排名第41，位列Q1区。本期刊面向全球开放获取，免收作者版面费 (APC)。期刊致力于打造材料科学领域的高水平综合性期刊，为全球材料领域科学家搭建学术交流与合作平台。刊载范围聚焦结构材料、能源材料、生物材料、纳米材料、量子材料、信息材料、材料理论与计算。
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