撰稿：棃心
校审：NeuExpress_北林
2024年7月22日慕尼黑大学的Arthur Liesz教授在Cell杂志上发表题为“Innate immune memory after brain injury drives inflammatory cardiac dysfunction”的研究性文章。研究团队运用了单细胞转录基因组及ATAC测序技术，分析了缺血性卒中后外周固有免疫系统的变化。通过在体及离体实验，在缺血性卒中小鼠模型中证实了心脏在急性脑损伤后会发生一系列不可逆的病理改变，如舒张性心功能不全、心脏传导功能障碍以及心脏的纤维化改变等。通过骨髓移植实验和单细胞转录基因组测序实验，进一步证实了这些心脏病变主要由卒中后重构的骨髓造血干细胞产生的促炎单核细胞介导产生。揭示缺血性脑卒中后的先天免疫记忆驱动炎症性心功能障碍的发生。
心房颤动、冠心病、充血性心力衰竭等各种心血管疾病是引发脑卒中的高危因素。流调显示，初次中风后各种心血管疾病的发生率也会增加，但具体机制不明。既往研究表明急性缺血性脑损伤会引发全身无菌性炎症，这主要通过免疫原性报警因子的释放迅速启动，如来自坏死细胞的核蛋白或DNA等。然而，与急性期炎症反应相比，脑损伤在慢性期对系统免疫的影响仍然未知。研究人员假设，中风后出现的高发病率的合并症可能有一个共同的免疫原因，特别是与骨髓中造血细胞的免疫记忆相关。利用单细胞测序技术，研究团队致力于探索中风后免疫系统的长期变化及其对心脏等远端器官的影响。
1. 脑卒中诱导全身单核细胞/巨噬细胞的长期炎症变化为了测试卒中后对长期全身性炎症的潜在影响，研究人员通过短暂性大脑中动脉闭塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAo)构建卒中模型，1个月后对小鼠的血液和心、肝、脾、肺等外周器官的CD45+、CD11b+髓样细胞进行了全面的单细胞mRNA测序分析，这些细胞先前被证实与急性期脑损伤的炎症有关，结果发现，卒中后单核/巨噬细胞群体中大量基因差异表达，其他细胞群体（如中性粒细胞和树突状细胞）受到的影响较小。卒中后单核细胞转录组特征与促炎表型相关，其特征是循环单核细胞和组织巨噬细胞的各种生物学相关炎症信号通路显著上调，包括参与趋化和细胞粘附的基因、细胞因子和IFN介导的信号通路的表达增加。基于共18,835个基因的主成分分析(PCA)显示，在各器官中，单核细胞/巨噬细胞群的变化在心脏和肝脏中尤为明显(图1E)。具体来说，我们检测到中风后1个月心脏中表达ly6Chigh的单核细胞群体的选择性扩增(图1F、1G)，这改变了单核细胞向心脏巨噬细胞的分化轨迹。中风后的心脏ly6Chigh单核细胞与组织驻留相关基因的表达增加。![]()
图1. 中风引起全身单核/巨噬细胞的长期炎症变化通过心脏多普勒超声发现，研究人员发现卒中后小鼠左心室舒张末期容积持续降低，收缩功能仅在急性期受到影响，卒中后期会出现心肌纤维化和心律失常(图2A-C)。通过表征中风后心脏细胞外基质的组成，发现心脏纤维化的增加主要由于I型胶原的沉积导致。二次谐波显微分析发现，中风之后左室心肌的纤维紊乱增加，心脏细胞外基质发生重构。进一步凝胶酶谱发现卒中后心机基质金属蛋白酶（MMP）活性增加，单分子荧光原位杂交（smFISH）检测到心脏巨噬细胞中Mmp9转录物增加，心脏单核/巨噬细胞的RT-qPCR证实这是心脏Mmp9表达增加的来源。我们也通过流式细胞术观察到中风后心脏中ly6Chigh单核细胞和CCR2+心脏单核/巨噬细胞数量增加(图2H和S2N)。这些结果表明，中风后循环单核细胞的浸润增加，单核细胞向巨噬细胞的分化增强。此外，卒中后循环单核细胞Mmp9的表达也显著增加(图2I)。![]()
图2. 中风导致慢性心脏舒张功能障碍和炎症性心脏重塑
作者在人类患者中验证了卒中后慢性心功能障碍的发展及心脏左室壁ECM的沉积增加。作者还发现心脏中CCR2+单核细胞计数显著增加，这和心脏胶原蛋白的含量相关，而单核细胞和巨噬细胞计数在正常人和卒中患者之间无明显差异。与先前的研究一致，人类的心脏巨噬细胞在中风后也表达了更多的Mmp9转录本，mRNA测序发现，卒中患者的多个上调基因（PON1和KRTCAP2）和ECM重塑相关。
图3. 中风增加人类患者的心脏纤维化和单核细胞积聚
研究人员使用可诱导性髓系组细胞报告小鼠（(Ms4a3creERT2xAi14），发现中风之后，心脏单核/巨噬细胞的募集长期存在。通过EDU（5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷）标记，发现95%以上的心脏中的髓系细胞在中风后1个月内被替换。作者通过使用Ccr2启动子标记的小鼠（Ccr2creERT2xAi14），无监督轨迹分析进一步证实了我们的发现，循环ly6Chigh单核细胞浸润心脏并获得组织驻留的单核细胞/巨噬细胞表型，作者还观察到卒中后入侵的Ccr2tdTomato细胞具有多种生物学相关信号通路上调的特征(图4I)。进一步的细胞-细胞相互作用分析，揭示了与组织纤维化和炎症相关的过程中大量上调的相互作用(而没有下调)(图4J)。使用原位smFISH检测I型胶原mRNA并结合波形蛋白染色，研究人员发现中风后慢性成纤维细胞中波形蛋白阳性的成纤维细胞显著增加，I型胶原转录物的表达也更高(图4K)。![]()
图4. 中风促进慢性单核细胞募集进入心脏
研究人员通过使用一种遗传学脑卒中耗竭小鼠模型（(poly(I:C) administration to Mx1Cre:c-mybfl/fl mice），将脑卒中或对照手术后1个月的骨髓中GFP+、富集的HSPCs移植到幼稚受体中，1个月后，通过分离GFP+移植骨髓细胞进行单细胞mRNA测序，证实所有分析动物的骨髓再生成功，各组间骨髓再生潜力无差异(图5G)。将移植小鼠之间最显著调节的转录组通路与中风和对照手术后1个月动物之间的原始差异进行比较，发现中风后移植细胞的表型高度保守(图5H)。来自脑卒中小鼠的骨髓细胞和来自移植脑卒中BM细胞的受体小鼠的骨髓细胞都保持了促炎激活表型。PCA投射分析发现，来自脑卒中BM移植小鼠的细胞与来自脑卒中小鼠的细胞在空间上接近，证实骨髓细胞在脑卒中后获得了一种独特的促炎表型，这种表型可通过脑卒中移植传播。骨髓移植1个月后，作者还从受体小鼠的心脏和血液中分离出GFP+移植骨髓细胞(CD45+CD11b+)。使用无监督聚类，在心脏和血液中发现了不同的髓系GFP+群体。通过对血液和心脏联合数据集的伪时间分析，作者观察到中风后从血液单核细胞到心脏单核细胞/巨噬细胞的分化轨迹发生了转变(图5I)。卒中后假时间轨迹的改变是由卒中后血液来源的ly6Chigh单核细胞对组织驻留的单核细胞和巨噬细胞的差异更高的贡献驱动的(图5I和5J)。接下来，研究人员分析脑梗死受体小鼠的心脏中风后观察到的ECM重塑的标志。接受脑卒中供者骨髓移植的小鼠心脏巨噬细胞中，Mmp9的表达显著增加，特别是在移植的GFP+心脏单核细胞/巨噬细胞中(图5K和5L)。此外，与对照组脑卒中受体相比，接受脑卒中移植的动物心脏纤维化明显增加(图5M)。总之，这些发现表明髓系功能是不仅在中风后稳定改变，而且这些髓系的改变足以驱动继发性心脏纤维化。![]()
图5. 中风诱导持久的先天免疫记忆
与对照小鼠的细胞相比，从中风小鼠中分离的原代单核细胞和骨髓来源的巨噬细胞具有更高的吞噬活性(图6A)。此外，中风小鼠的细胞也显示出对细胞因子刺激的反应增加，总体上证实了中风引起的训练免疫的发展。训练免疫的一个特征是骨髓细胞的表观遗传重编程。作者首先在中风后1个月评估组蛋白修饰或对照小鼠的关键组蛋白标记，并确定了增强相关标记(H3K4me1和H3K27ac)以及H3K4me3的变化，H3K4me3是一种与活性启动子相关的组蛋白修饰。接下来，作者在HSPC中发现了几种TF基序的差异富集，包括CTCF、STAT1/2、GABPA、CEBPD、GFI和KLF14(图6B)。这些TF先前已被描述为调节HSPC的存活和增殖，它们向髓系谱系的分化以及它们的炎症表型。研究人员还评估了脑卒中或对照组1个月后小鼠分离的成熟单核细胞的染色质谱我们发现单核细胞中的H3K4me3水平与卒中后的多种TF基元紧密相关，包括CTCF和与NF-kb和IL-1信号通路相关的几个区域以及促炎反应，如E2F2、ATF7、STAT1和KLF14(图6C)。之前的研究发现，在包括中风在内的组织损伤的反应中，全身炎性体激活和随后的IL-1β分泌，血清IL-1β浓度在损伤后的第一个小时内达到峰值，与脂多糖刺激后观察到的峰值水平相似。实验感染模型的研究表明，IL -1β介导的作用参与了表观遗传重编程。因此，作者对转座酶可及的染色质进行了单细胞测序(ATACseq)，以分析对照组小鼠和中风后1个月接受IL -1β中和抗体或对照的动物的开放染色质可及性。对照组小鼠相比，在HSPC和成熟的ly6Chigh单核细胞簇中发现，与中风后1个月染色质可及性存在明显差异。接下来，我们特别关注潜在重要的细胞类型特异性差异活性调控序列，并确定了TF基序在卒中和对照条件之间的显著变化(图6E)。这些分析证实中风导致造血干细胞(hsc)中几种TF活性的显著改变，包括CTCF、ETV4和RUNX2，这些TF先前被描述为调节HSPC功能。同样，我们也确认卒中通过改变参与应激和免疫反应的TF相关基序可及性，如CTCF、NRF1(也称为NFE2)和FOS:JUND(AP1)，改变了成熟ly6Chigh单核细胞的表观遗传景观。重要的是，在HSPC和成熟的ly6Chigh单核细胞中，IL -1β中和阻止了大多数中风引起的染色质可及性变化(图6E)。这些TF相关的对照和中风条件之间差异表达的基因参与炎症和细胞因子信号传导，包括IL -1β信号传导。最后，为了证实IL -1β驱动中风后观察到的表观遗传重编程，我们对重组IL -1β处理的BM(即HSPCs)细胞中富含HSPC的髓系部分进行了大量ATAC测序。我们观察到IL -1β处理的HSPCs在一系列基因组区域的染色质可及性发生了显著变化，尽管大多数变化是定量的(图6F)。该分析显示，在IL -1β处理的HSPCs中，TF基序的富集与实验脑卒中后组蛋白修饰位点分析和单细胞ATAC-seq分析中发现的一致。总之，这些结果证明了IL -1β在诱导表观遗传变化导致卒中后免疫的关键作用。![]()
图6. 中风后早期IL-1β的分泌介导先天免疫记忆
6. IL-1β驱动的先天免疫记忆介导卒中后远端器官功能障碍作者为了进一步测试IL-1β在卒中后骨髓生成增加和单核细胞向心脏募集中的作用，研究人员在未发生脑卒中的小鼠注射重组IL-1β，通过流式细胞术发现rIL-1β处理的小鼠心脏中ly6Chigh单核细胞和CCR2high单核/巨噬细胞大幅增加(图7B)，骨髓生成相应增加，其特征是注射rIL-1β后HSPCs和成熟单核细胞计数升高(图7C)。值得注意的是，脑卒中动物在接受IL-1β特异性抗体中和后，BM细胞水平可恢复至对照小鼠水平。反过来，急性期的抗IL-1β治疗减少了卒中后1个月循环ly6Chigh单核细胞计数(图7F)，并且在IL-1β中和后，卒中后CCR2high的心脏单核/巨噬细胞的增加也恢复到控制水平(图7G)。相应的，通过给予caspase-1抑制——VX-765，同样可以阻止脑卒中后骨髓生成的增加。值得注意的是，脑卒中后2周延迟中和IL-1β未能挽救脑卒中后骨髓生成的增加，证实脑卒中后炎性体依赖的急性IL-1β释放，而不是潜在残留循环IL-1β的慢性刺激，启动脑卒中后骨髓生成和心脏病理的增加。最后，作者观察到早期IL-1β释放的急性(但不是延迟)中和足以通过显着降低心脏单核细胞/巨噬细胞的Mmp9表达和心脏纤维化到无卒中对照小鼠的水平来预防长期心脏表型(图7H, 7I和S7E)。这些发现表明，IL-1β驱动的表观遗传变化导致的免疫训练可能与中风后慢性心脏纤维化的介导有因果关系。![]()
图7. IL-1β驱动的先天免疫记忆介导脑卒中后心功能障碍
7. 阻断骨髓到心脏的单核细胞迁移可预防中风后心功能障碍研究人员进一步使用CCR2/5双重拮抗剂cenicriviroc (CVC)阻断促炎髓细胞向次要器官的迁移。在实验性脑卒中后，每天使用CVC治疗可显著减少单核细胞向心脏的募集(图7J、7K)。这种作用可能是由于CVC增加了循环中ly6Chigh的单核细胞计数，而对单核细胞没有直接的细胞毒性作用，从而阻断了趋化因子依赖的单核细胞向次级器官的侵袭。因此，CVC治疗显著降低了Mmp9在心脏单核细胞/巨噬细胞中的表达，减少了心脏纤维化(图7L、7M)，也显著改善了脑卒中后远期的舒张功能障碍，其水平与未发生脑卒中的对照组小鼠相当(图7N)。综上所述，这些结果表明，通过阻断促炎单核细胞从骨髓到心脏的迁移，可作为预防中风后继发性心脏合并症的一种策略。图8. 阻断骨髓到心脏的单核细胞迁移可预防中风后心功能障碍
该研究为理解中风后心脏功能障碍的免疫机制提供了新的视角，为预防和治疗中风后的心脏并发症提供了新的理论依据和治疗靶点。通过阻断IL-1β和抑制促炎细胞向心脏的迁移，可以成功预防中风后的心脏问题，为临床治疗提供了新的策略。缺血性卒中后，外周固有免疫系统在慢性期会发生炎性重构，主要表现为与髓系再生相关的表观遗传调控改变以及显著增强的髓系造血反应。随着促炎单核细胞的不断产生以及向周围器官的浸润，包括心脏在内的周围器官的免疫微环境被长期改变。卒中后骨髓固有免疫记忆主要由IL-1β刺激产生，这些单核细胞向心脏浸润并分化为驻留型巨噬细胞，产生超量的金属基质蛋白酶-9以及激活成纤维细胞等，从而导致心脏功能障碍。Arthur Liesz教授来自德国慕尼黑大学（Ludwig Beckhoven University of Munich）中风与痴呆研究所，同时也是慕尼黑大学医学中心（University Hospital Munich）的认证神经学专家。Arthur Liesz教授在神经科学和免疫学领域有着深厚的研究背景，特别关注脑卒中、脑损伤后的免疫反应及其对远端器官（如心脏）的影响。他的研究团队致力于揭示中风后免疫系统的长期变化及其对系统性疾病的影响。
https://www.isd-research.de/liesz-labhttps://doi.org/10.1016/j.cell.2024.06.028如果您对脑科学传播感兴趣，或者期待通过撰写文献解读督促自己阅读和思考最新的文献，亦或者是您想通过撰写文献解读锻炼自己的科学写作能力，欢迎联系NeuExpress编辑部，联系方式：
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