撰稿：奚笛
校审：NeuExpress_北林
在成年神经元中，染色质的可塑性是否在记忆痕迹形成中起着关键作用，以及这种染色质的异质性是否决定了哪些神经元会被优先选择用于信息编码和记忆形成。
2024年7月26日，洛桑联邦理工学院（Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne）的Johannes Gräff教授在Science期刊发表了题为“Chromatin plasticity predetermines neuronal eligibility for memory trace formation”的研究论文。该研究主要探讨了染色质的可塑性如何预先决定神经元在记忆痕迹形成中的选择性参与。研究发现，在成年神经元中，染色质的可塑性表现出异质性，并且这种可塑性与神经元的活性编码能力密切相关。通过实验操作，研究团队证实了增强染色质的可塑性有助于神经元被招募到记忆网络中，而降低染色质的可塑性则会阻碍记忆的分配。此外，该研究还揭示了染色质可塑性与神经元的内在兴奋性之间的直接联系，为理解记忆编码的分子机制提供了新的视角。
神经元的身份源于其在发育过程中通过稳定的染色质重塑实现的谱系承诺。然而，许多认知过程只涉及一小部分看似相同的神经元的参与，这引发了一个问题：是否更细粒度的染色质可塑性能够决定哪些神经元有资格在发育定义的神经元生态位中承担专门的大脑功能。记忆分配是一种依赖于神经元选择的认知过程，因为存储特定记忆的细胞网络只占接收类似输入的总神经元数量的一小部分。选择性地将神经元招募到编码集合中依赖于体细胞可塑性，例如内在兴奋性（IE），但目前尚不清楚染色质层面的核可塑性在多大程度上有助于信息编码的神经元选择。
1. 小鼠侧杏仁核（LA）的神经元表现出与记忆分配相关的内在染色质可塑性为了探究这一问题，作者专注于小鼠侧杏仁核，这是巴甫洛夫恐惧学习期间突触可塑性的关键部位。作者首先评估了LA主要神经元中的染色质压缩是否显示出内在的异质性，这是作为功能性神经元专业化驱动因素的必要前提。作者通过免疫组织化学法测量了涉及维持转录沉默异染色质的异染色质蛋白-1（HP1-b）的神经元含量，在CaMKIIa神经元中进行（这是LA中的主要神经元类型）。这一测量在听觉恐惧条件任务（aFC）后一小时进行，该任务可诱导记忆保持，以及在作为基线表观遗传状态参考的家笼（HC）对照组中进行。作者发现LA细胞表现出广泛的HP1-b水平，表明染色质压缩的内在异质性。更重要的是，作者在aFC后观察到HP1-b含量显著减少，表明恐惧学习诱导了整体染色质松弛。接下来，为了评估这种染色质松弛是否可能影响记忆分配，作者评估了cFos阳性细胞群体中HP1-b的表达，cFos是一种立即早期基因（IEG）的神经元活性标记，用于识别潜在的记忆细胞。在aFC后，cFos阳性（cFos+）的集合显著增大，证实LA被aFC积极地激活。然而，作者没有发现cFos+和cFos阴性（cFos-）细胞之间异染色质含量的特定差异。因此，使用相同的实验设置，作者接下来研究了组蛋白乙酰化（图1，A和C），这是染色质可塑性的主要调节因子，发生在组蛋白核心蛋白的特定氨基酸残基上。作者专注于分析两个位点的乙酰化，即组蛋白3在赖氨酸27（H3K27Ac）和H4K5Ac上的乙酰化，这两种乙酰化都是由神经元激活诱导的，并跟随记忆形成。与HP1-b类似，作者观察到LA主要神经元中组蛋白乙酰化内在发生的异质性。与HP1-b不同，aFC并没有改变H3K27Ac和H4K5Ac水平的整体分布。然而，当作者分析cFos+神经元中的组蛋白乙酰化时，作者发现H3K27Ac有显著的富集，但H4K5Ac没有，与cFos-细胞相比。这些变化特定于联合学习，因为经历即时休克缺陷范式的小鼠—一种非联合体验—并没有显示出cFos+集合大小的增加或H3K27ac的富集。这些发现表明，尽管像aFC这样的显著体验可以促进LA内的整体染色质松弛，但在特定的细胞集合中，不同的表观遗传修饰在起作用以界定它们的专门功能。![]()
图1. 加入编码集合的神经元显示H3K27Ac水平升高。
2. 组蛋白乙酰转移酶（HAT）的过表达增加了H3K27Ac并有利于记忆痕迹分配为了测试富含H3K27ac的LA主要神经元是否可能倾向于记忆痕迹的招募，作者随后操纵了组蛋白乙酰化水平。组蛋白乙酰化受到组蛋白去乙酰化酶（HDACs）和组蛋白乙酰转移酶（HATs）的相反作用的调节，后者由18种不同的蛋白质组成。为了实验性增加H3K27ac，作者过表达了HAT家族中系统发育对立两端的两个成员，CREB结合蛋白（CBP）和赖氨酸乙酰转移酶5（KAT5）(图2A)。携带CBP、KAT5或对照eGFP报告基因的慢病毒在CaMKIIa启动子的控制下被双侧注射到LA中；此后，小鼠经历了与之前相同的听觉恐惧条件任务（aFC）。所有插入物都与Myc-Flag标签融合，用于核可视化，eGFP有助于识别注射部位（图2B）。CBP和KAT5的过表达在aFC后一小时以及在家笼（HC）对照组中都导致了H3K27Ac水平的提升（图2C至E），包括在aFC和HC组中的cFos阳性细胞（图2F和G）。然后作者检查了这样改变的组蛋白乙酰化是否影响了神经元成为编码集合一部分的倾向，也就是记忆分配。在听觉恐惧条件（aFC）后，cFos+神经元更倾向于被招募到HAT感染的部分（图2H和I），而在对照组（HC）中没有观察到这种差异（图2J）。这不是由于编码集合的大小变化（图2K），也不是由于基线冻结行为的差异（图2L），也不是由于感染率的改变。此外，这种效应是由CBP和KAT5的HAT结构域特异性介导的，因为过表达催化死亡突变体（HATDM）并没有改变记忆分配。相反，当作者过表达HDAC2，一种I类HDAC时，记忆分配保持不变。最后，当作者通过过表达针对CBP的shRNAs来降低H3K27ac水平时，记忆分配减少了，这表明提高的组蛋白乙酰化有利于记忆分配。
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图2. HAT过表达增加H3K27Ac水平，有利于内存分配。
3. HAT过表达在IE和突触相关基因处诱导表观遗传和转录变化接下来，作者检查了HAT过表达（OE）可能通过哪些表观遗传和转录机制促进记忆分配。小鼠被注射了含有CBP、KAT5或eGFP的慢病毒载体，10天后LA核被分离，并通过单核（sn）多组学测序进行了表征，以同时评估它们的染色质可及性（snATAC-seq）和基因表达（snRNA-seq）的变化（图3A）。这个实验在HC队列中进行，因为作者假设为了在记忆编码时被优先招募，HAT感染的神经元在基线时就会携带特定的表观遗传和转录特征。这三个数据集显示了可比的细胞类型组成（图3B），并以预期的细胞类型比例（80%的兴奋性与20%的抑制性神经元）和兴奋性神经元的亚聚类在LA中进行了表征（图3C）。兴奋性神经元是由CamKII驱动的病毒构建物优先靶向的细胞类型，因此是作者详细探索的群体（图3D和图S6，E至G）。使用cFos和其他快速IEGs的表达水平，作者首先将LA兴奋性神经元分类为活跃和非活跃的簇（图3E），并研究了HAT OE对这些簇的影响。无论它们的活动状态如何，HAT感染导致簇分离，表明HAT OE在基线时已经诱导了转录差异。同样，尽管HAT OE在全局上并没有在染色质可及性或组成性转录位置（如管家基因）上产生差异（图3F和图3G），HAT感染使与活动相关的位点（如快速IEGs）的异质分布向更高的可及性状态倾斜（图3H），表明HAT OE在表观遗传上使细胞倾向于活动。但是HAT OE是如何精确地促进这种向活动的转变的呢？在接下来的分析中，作者专注于比较实验条件下感染的神经元。CBP-、KAT5-和eGFP感染神经元之间的差异可及性（DA）测量显示，启动子元素主要获得了可及性（图3I），这进一步与H3K27Ac峰显示出高度（>95%）重叠，CBP和KAT5 OE时分别获得了1.5到2的可及性增加（图3K）。相应地，差异基因表达（DE）分析发现HAT OE诱导了显著的基因上调，而下调很少（图3L）。通过DA-DE交叉分析，作者观察到获得的启动子可及性和转录上调之间在功能上有高度的重叠，特别是在与突触相关的本体上（图3M）。在这些富集的基因中，作者发现两种HAT都针对与结构和突触功能密切相关的位置，如突触囊泡蛋白（Syp）、蛋白激酶C（Prkcg）、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶2b（Camk2b）或脱蛋白肌动蛋白结合蛋白（Dmtn），而其他则与神经元兴奋性和放电有关，如钙电压门控通道（Cacng3）、钠依赖性磷酸盐转运蛋白（Slc17a7）、谷氨酸受体（Grin1）和谷氨酸受体相互作用蛋白1（Grip1）（图3N）。然而，在单个基因水平上，HAT效应似乎只诱导了DA或DE（图3N），很少有两者都表现的。为了更好地理解这种二分法背后的机制，作者检查了在eGFP条件下，获得可及性的启动子和HAT OE后变得上调的基因是否已经在转录起始位点（TSS）表现出不同的ATAC信号。作者发现，HAT OE后转录上调的基因特征是基线时TSS已经可及（DE基因在图3O中），而获得可及性增加（但没有上调）的基因则以不太可及的TSS为特征（DA基因在图3O）。这种可及性增加可能发生在TSS处[DA@TSS, ±50个碱基对（bp）]或扩展到扩展启动子区域的调节序列（DA≠TSS，见材料和方法）（图3，P和Q）。发生的是哪种可及性增加场景再次取决于基线染色质状态：DA@TSS基因是在基线时最闭合的，而DA≠TSS基因表现出与DE基因相当的允许TSS可及性（图3R）。这些染色质可及性的差异也反映在不同的基线表达水平上，即具有更允许的TSS的基因比闭合的启动子显示出更高的转录活性（图3，S和T）。最后，虽然DE和DA≠TSS基因显示出类似的转录因子基序富集，但DA@TSS特定地富集在FOS::JUN和RXRG基序中，这些转录因子先前被涉及刺激依赖性可塑性和IE。图3. HAT过表达可诱导IE和突触相关基因的表观遗传和转录变化。
4. HAT过表达增强了内在兴奋性并诱导了突触重塑由于HAT过表达在与内在兴奋性（IE）和突触功能相关的位点上诱导了表观遗传和转录可塑性，作者接下来检查了是否有伴随这些以染色质为模板的效应的功能变化。首先，作者测量了神经元的IE，这是控制记忆分配的关键体细胞特征（图4，A至D）。作者在LA区双侧注射了携带CBP、KAT5或对照eGFP报告基因的慢病毒，10天后小鼠被准备进行体外膜片钳记录。在注射eGFP的小鼠中，病毒感染的细胞中测量的IE参数均未改变（图4，E和F），表明基于病毒的操作本身并没有改变神经元属性。相比之下，HAT过表达影响了多个电生理参数，这些参数表明IE增加：与未感染的神经元相比，两种HAT都增加了由去极化电流注射所诱发的动作电位数量（图4，G和I），并且HAT感染的神经元显示出后超极化电位幅度的减少（图4，H和J），这定义了动作电位后的不应期。此外，在CBP-（而不是KAT5-）过表达细胞中，与提高IE特征相关的其他几个属性显著改变，例如，阈值降低。值得注意的是，HATDM感染的神经元在任何IE参数上都没有差异。接下来，作者询问HAT过表达是否也能在突触水平促进功能和结构重塑。微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）的记录显示，感染了CBP和KAT5的LA神经元显示出谷氨酸输入频率的增加，这由mEPSCs事件间隔的减少表明（图4，K-M）。相反，mEPSC峰值幅度与未感染的细胞相当，表明在学习之前突触后AMPARs密度没有变化。与电生理数据一致，HAT过表达还增加了与eGFP对照条件相比的棘密度（图4，N-P）。这些结果表明染色质可塑性直接以细胞内方式作用于IE和突触重塑，并且与最近的发现很好地一致，即在记忆网络中，学习之前建立的强相互连接有利于细胞的招募。
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图4. HAT过表达增加IE和突触功能。
5. HAT过表达有助于记忆保持，而光遗传学抑制HAT感染的神经元会破坏这一过程为了真正被认为是影响记忆分配的过程，它还应该支持记忆保持。为了测试这一点，作者在听觉恐惧条件（aFC）范式中检查了HAT过表达（OE）的效果，在这种范式中，作者不仅可以测试对条件刺激（CS+）的记忆保持，还可以测试小鼠对非条件刺激（CS-）的辨别能力（图5，A和B）。注射CBP和KAT5的小鼠在编码后24小时显示出明显更高的冻结反应，这种冻结反应的增加特定于CS+的呈现（图5C）。此外，当作者在编码后8天重新测试这些小鼠的一个亚群时，注射CBP和KAT5的小鼠在CS+时段期间仍然表现出提高的冻结反应（图5D），表明长期记忆保持能力有所提高。作者在编码阶段的基线冻结或运动活动中没有观察到差异，排除了HAT OE介导的冻结增加是由于非特异性的不动增加的可能性。而且，HAT OE的记忆促进效果特定于aFC的联合组成部分，因为在即时休克范式中，HAT过表达的小鼠没有显示出记忆保持能力的提高。为了因果性地检查HAT过表达的神经元是否以细胞内在的方式负责提高记忆保持能力，作者设计了一个病毒系统，允许作者通过在同一启动子下表达抑制性视蛋白ArchT来光遗传学地抑制表观遗传学改变的神经元。这些病毒被双侧注射到LA中，植入了光纤，11天后小鼠经历了相同的aFC协议（图5E和F）。在记忆回忆期间，作者将抑制性光刺激与一半的CS+呈现耦合，这允许在光关闭（无沉默）与光开启（沉默）期间进行个体内部的冻结反应比较（图5E）。在关闭光时段的冻结行为分析证实了HAT OE小鼠中加强的恐惧反应（图5C和G）。相反，HAT过表达神经元的光遗传学抑制阻止了恐惧记忆的表达（图5H）。相比之下，在对照小鼠中沉默随机的LA神经元群体没有改变冻结反应（图5H）。
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图5. HAT过表达促进了HAT感染神经元的记忆保留，而光遗传沉默则破坏了HAT感染神经元的记忆保留。
6. IE和组蛋白乙酰化在单细胞水平上细胞自主地相关到目前为止的HAT OE实验揭示了提高的组蛋白乙酰化水平与神经元记忆分配的资格之间的功能关系，并指出IE是一个表观遗传学模板化的效应过程。为了理解这种关系是否反映了内在发生的机制，作者实时在单细胞分辨率下研究了组蛋白乙酰化与IE之间的联系。作者设计了一种方法，将组蛋白乙酰化的福斯特共振能量转移（FRET）成像技术与原代神经元培养中的基因编码的钙指示剂相结合。对于前者，作者使用了FRET探针Histac3，它以反向关系荧光报告组蛋白乙酰化水平：只有当组蛋白乙酰化水平较低时，分别位于H3及其阅读器溴结构域4上的供体和受体分子才会进入足够接近的物理距离，在供体的光激发下发出FRET信号（图6A）。对于后者，作者使用了jRCaMP1b，一种红移的基因编码的Ca2+指示剂，允许在单细胞水平测量Ca2+瞬变（图6B）。作者在KCl刺激前后测量了FRET和Ca2+信号，以研究它们作为神经元活动函数的关系（图6C和D）。成像的神经元在组蛋白乙酰化方面表现出高度的异质性（图6E），与体内LA中的观察一致。为了将组蛋白乙酰化与IE状态联系起来，作者随后将分析重点放在最极端的FRET类别，LOW FRET和HIGH FRET（分别表示高和低乙酰化含量）（图6F）。虽然LOW和HIGH FRET细胞都对神经元活动有升高的Ca2+活动反应（图6，G和H），但LOW-FRET神经元显示出更持久的增加（图6I）。更重要的是，LOW-FRET神经元比HIGH-FRET细胞更早地对KCl作出反应，后者在达到峰值前显示出延迟的时间滞后（图6J）。最后，LOW-FRET神经元在神经元活动后表达了显著更高的平均放电率（图6，K-M），表明高乙酰化的神经元以细胞内在的方式显示出更快、更强和更稳定的放电增加。
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图6. 组蛋白乙酰化和IE在单细胞分辨率下以细胞自主方式联系在一起。
作者发现神经元的表观遗传构成预先决定了它被招募到记忆痕迹的资格，这确定了一种基于稀疏信息编码的核可塑性形式。通过针对体细胞和突触效应机制，这种以染色质为模板的可塑性可能控制了神经元属性内在波动的看似随机的性质。值得注意的是，作者观察到这种联系是细胞内在的并且实时发生的，这将染色质可塑性定义为影响记忆分配的细胞自主特征。然而，为了进一步协调记忆编码的稀疏性，很可能也涉及到非细胞自主机制，如侧抑制。尽管这一预测还有待正式测试，但通过观察到HAT OE没有改变整体集合大小（图2K），以及改变的表观遗传和转录和IE（图4，E-M）特征特定于感染的神经元，这一点得到了支持。尽管使用了两个系统发育距离较远的HATs，它们最显著的效果集中在重叠的基因组位置上，这表明在LA兴奋性神经元中，特别容易受到表观遗传和转录变异的基因组区域围绕着IE和突触传输的功能。特别是，HAT的作用机制揭示了染色质可及性的高动态性在有丝分裂后的神经元中的存在，这可以根据HAT遇到的染色质环境，指导基因的启动（DA@TSS基因）、加强其染色质架构（DA≠TSS基因）或增强其转录（DE基因）。有了这种倾向，神经元的表观遗传景观可能代表一种适应性机制，以动态但持久的方式注册和整合环境信号，类似于基因组动作电位的概念。这种表观遗传景观反过来如何受到其他表观遗传标记、代谢率或昼夜节律的影响，其确切的时间尺度，以及其失调是否可能导致神经性疾病中记忆分配的改变，目前尚不清楚。尽管存在这些未解决的问题，但目前的发现表明，表观遗传机制——除了在发育期间稳定地定义神经元生态位的形成——在预先决定更高层次的神经元功能方面是必不可少的。Johannes Gräff博士，瑞士洛桑瑞士联邦理工学院(EPFL)副教授，神经科学博士学院(EDNE)主任。Johannes Gräff出生并成长在瑞士的德语区圣加仑。高中毕业后，他越过语言边界来到讲法语的洛桑大学(University of Lausanne)，在那里完成了他的本科学业。在此期间，他在加拿大温哥华的不列颠哥伦比亚大学(UBC)呆了一年，在那里他开始对神经科学和心理学产生兴趣。2005年，他与劳伦特·凯勒(Laurent Keller)共同完成了硕士论文，主要研究蚂蚁衰老的遗传原因。他对基因如何影响行为(反之亦然)很感兴趣，于是在瑞士联邦理工学院(ETHZ)的Isabelle Mansuy实验室开始了一篇博士论文，专门研究调节学习和记忆的神经表观遗传机制。他于2009年获得博士学位，并在那里做了一段时间的博士后。2009年，他来到美国马萨诸塞州剑桥的麻省理工学院，在蔡丽慧老师的指导下开始了他的博士后工作。在此期间，他首次证明了表观遗传机制与神经退化相关的认知能力下降以及创伤后应激障碍小鼠模型中的长期创伤记忆更新有因果关系。2013年，Johannes Gräff被EPFL聘为生命科学学院大脑研究所的终身助理教授。2020年晋升为终身副教授。Johannes Gräff也是FENS-Kavli卓越网络的创始成员，前MQ研究员，NARSAD独立调查员，现任VALLEE学者和ERC StG和ERC CoG的持有人。https://people.epfl.ch/johannes.graeff?lang=enhttps://www.science.org/doi/10.1126/science.adg9982如果您对脑科学传播感兴趣，或者期待通过撰写文献解读督促自己阅读和思考最新的文献，亦或者是您想通过撰写文献解读锻炼自己的科学写作能力，欢迎联系NeuExpress编辑部，联系方式：
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