撰稿：奚笛
校审：NeuExpress_北林
通过单细胞转录组分析，揭示了阿尔茨海默病在不同大脑区域中的细胞类型特异性变化，为理解该疾病在大脑中的区域性进展提供了分子层面的见解，并识别了与认知弹性相关的细胞和分子机制。
2024年7月24日，麻省理工学院（MIT）的Manolis Kellis教授及其团队在Nature期刊发表了标题为“Single-cell multiregion dissection of Alzheimer's disease”的研究论文。该研究主要构建了一个单细胞转录组图谱，涵盖了来自48位生前有无阿尔茨海默症（Alzheimer's disease, AD）诊断的个体的六种不同大脑区域，共分析了超过130万个细胞。研究识别了76种细胞类型，包括特定区域的星形胶质细胞亚型、兴奋性神经元以及独特于丘脑的抑制性神经元群体。此外，研究还发现了AD中特定大脑区域中易受损的兴奋性和抑制性神经元群体，并提供了证据表明Reelin信号通路参与调节这些神经元的脆弱性。研究还开发了一种可扩展的基因模块发现方法，用于识别AD中改变的细胞类型特异性和区域特异性模块，并注释与多种病理变量相关的转录组差异。研究还识别了一个与认知弹性相关的星形胶质细胞程序，将星形胶质细胞中的胆碱代谢和多胺生物合成联系到晚年保持的认知功能。总体而言，该研究为理解人类大脑老化的区域特性以及对AD病理的细胞脆弱性、反应和弹性提供了新的见解。阿尔茨海默病（AD）的特征是在多个大脑区域中以一种固定模式发生病理性蛋白聚集。AD的死后诊断是通过这些病理标志物的严重程度和分布来分期的：细胞外的淀粉样β-蛋白沉积和细胞内的神经纤维缠结（NFTs）。这些缠结最初出现在内嗅皮层（EC）（Braak分期I–II），然后是海马体和丘脑（Braak分期III–IV），最后是新皮层（Braak分期V–VI），这一顺序通常与认知功能从轻度认知障碍到严重痴呆的下降同步。理解受影响大脑区域的细胞结构对于早期和区域特异性的治疗干预具有重要意义，并可能揭示病理区域进展的分子机制。尽管一些与AD相关的大脑区域已经在个体或少数个体样本中单独或联合研究过，但目前还缺乏对AD区域特异性差异的全面分子特征描述，这可能捕捉到区域分子结构的差异以及AD中特定神经元和胶质细胞亚型的变化，以及对AD病理的认知韧性。在这里，作者展示了一个跨越六个不同解剖区域的人脑转录组图谱，这些人既有阿尔茨海默病痴呆症也有无痴呆症，作为理解与疾病相关差异的基础。作者对来自48位个体（其中26位有AD病理诊断）的EC、海马体（HC）、前丘脑（TH）、角回（AG）、中颞叶皮层（MT）和前额叶皮层（PFC）的超过130万个细胞核进行了转录组分析。作者注释了区域特异性的神经元和胶质细胞亚型多样性，并提供了一个在线资源来导航这个图谱（http://compbio.mit.edu/ad_multiregion)，并提供了对AD的细胞脆弱性、反应和韧性的机制见解。为了表征人脑中的细胞多样性，以及在AD进展过程中贯穿大脑区域的基因、途径和细胞类型，作者对来自宗教秩序研究（ROS）或鲁什记忆与衰老项目（MAP）的48名参与者的283个死后大脑样本中的细胞核进行了单核RNA测序（snRNA-seq）分析（统称为ROSMAP；图1a）。作者根据AD的病理诊断选择了48名参与者（根据NIA-Reagan评分26分（有AD）和22分（无AD；标记为非AD）进行分层），并根据临床诊断为阿尔茨海默病痴呆（n = 16）与非痴呆（n = 32）进行选择（图1a，扩展数据图1a和补充表1）。在这48名个体中，作者分析了六个大脑区域：内嗅皮层（EC，221,493个细胞），在早期AD（阶段I–II）中受影响；海马体（HC，221,415个细胞）和前丘脑（TH，207,625个细胞），在中期AD（阶段III–IV）中受影响；角回（AG，220,409个细胞）、中颞叶皮层（MT，227,412个细胞）和前额叶皮层（PFC，254,721个细胞），在晚期AD（阶段V–VI）中受影响，总计在移除双体细胞、低质量细胞和高度样本特异性簇后，获得了135万个独立细胞核的转录组。作者在14个主要细胞类型组中注释了76种高分辨率细胞类型，包括32种兴奋性神经元亚型（436,014个细胞核，占总数的32.2%）和23种抑制性亚型（159,838个细胞核，占总数的11.8%）（扩展数据图1b–d，补充图1和2以及补充表2）。作者根据它们的转录组大小和增殖状态对这些细胞类型进行了表征，并将作者的图谱与之前跨物种发布的数据进行了比较（扩展数据图1e，f和补充图3–5），并使用非负矩阵分解（NMF）和SCENIC识别了广泛的细胞类型身份程序和转录调控子（扩展数据图2和3以及补充表3和4）。
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图1. 老年人大脑六个不同区域的snRNA-seq分析。
为了深入了解人脑的细胞结构，作者研究了六个大脑区域主要细胞类型组成的差异。从丘脑（TH，14.4%的神经元）到三层结构的海马旁皮质（HC，32.2%的神经元），内嗅周皮质（36.6%的神经元）以及六层结构的新皮质区域（AG、MT和PFC，58.9%的神经元），神经元的比例显著增加（图1b–e和补充图6）。包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPCs）和微胶质/免疫细胞在内的胶质细胞，在新皮质样本中往往较少（图1b–e），这与之前在人类和老鼠中的研究一致（补充图7a–d）。不同区域主要细胞类型组成的差异在研究参与者中反复观察到，与个体的疾病状态无关（补充图7e–h），表明区域间主要细胞类型组成的变异是人类大脑的基本特征，不受AD病理的影响。作者首先表征了兴奋性神经元亚型的区域多样性，这些亚型在个体间是一致的，并且要么高度特定于HC、EC和TH（分别为7、9和2个亚型），要么主要在新皮质区域共享（12个亚型）（图1f和补充图8–12）。海马体亚型包括来自高度结构化的CA1和CA2/CA3亚区以及齿状回和更接近内嗅的下托和副/前下托区域的神经元。特定于EC的亚型，与相同层的新皮质亚型分开聚类，通常以RELN、TOX3和GPC5的表达为标志，并包含了来自外侧（L2 RELN+GPC5+）和内侧（L2 TOX3+POSTN+）EC的亚型（补充图10）。丘脑的兴奋性神经元主要由一个亚型（NXPH1+RNF220+，占74%）组成，这在新皮质中未观察到，预计受LHX9、SOX2、SHOX2和TCF7L2的调控（扩展数据图2a,b和补充图9e–i和11n,o）。作者发现丘脑-新皮质分离在小鼠中是保守的，并且在独立单细胞、批量和微阵列数据中，无论是小鼠还是人类，都重现了这种分离和丘脑标记基因（补充图12）。与兴奋性神经元亚型相反，大多数抑制性神经元亚型（23个亚型中的22个）在所有五个皮质区域中都有观察到（图1g和补充图13–17），尽管一些抑制性亚型有区域偏好，包括PVALB+HTR4+和CUX2+MSR1+（在新皮质中富集），第6层SST+NPY+（EC和HC）和GPC5+RIT2+（EC），这表明新皮质和海马旁皮质之间在抑制性神经元组成上存在显著差异（图1g和补充图14）。此外，在HC、EC和MT中，来自尾神经节隆起的GABA能神经元（VIP+LAMP5+）明显比来自内侧神经节隆起的神经元（SST+PVALB+）更丰富，但这两个主要类群在PFC中没有显著差异（扩展数据图1g）。相比之下，TH包含了一个单一的独特、特定于丘脑的抑制性亚型（MEIS2+FOXP2+），其特征是参与神经突生长的基因，如半胱氨酸蛋白酶SEMA3C和SEMA3E、DISC1和SPON1，以及5-羟色胺（HTR2A）、乙酰胆碱（CHRM2, CHRNA3）和谷氨酸（GRM3）的受体（图1g,h和补充图14和15）。这些基因位于一个单一的抑制性程序（Inh-22，来自NMF）中，包括SCENIC预测的亚型调节因子FOXP2和LEF1（扩展数据图2c,d和3b）。作者使用之前发布的单细胞数据在小鼠丘脑和人类外侧膝状体（dLGN）中重现了这种丘脑差异和程序基因（补充图16和17）。为了验证丘脑抑制性神经元亚型标记的定位和特异性，作者在四个个体的TH和PFC死后脑样本上进行了FOXP2和MEIS2与GAD2的原位杂交，发现这两个标记基因与GAD2在丘脑特异性共定位（图1i）。由于丘脑MEIS2神经元表达几种典型的谷氨酸能神经元基因，作者为每个神经元细胞确定了谷氨酸能和GABA能模块得分，以进一步检查这个亚型的嵌合性质（补充图15g–k和补充表5）。这些得分与皮层兴奋性和抑制性分裂相匹配，并且在广泛的神经元类别之间和内部都是负相关的（图1j和补充图15g,h）。丘脑MEIS2+抑制性和NXPH1+兴奋性神经元都有中间得分，将它们置于皮层兴奋性和抑制性簇之间，表明它们在表达皮层谷氨酸能与GABA能程序方面较少极化（图1j和补充图15i–k）。预测的细胞间通信相互作用在多个区域大多共享，但丘脑有多个不同的相互作用（补充图18和19）。顶级的丘脑特异性相互作用是兴奋性NXPH1与神经元NRXN1或NRXN3之间，而抑制性神经元在其他区域表达NXPH1，表明神经突触素信号从丘脑的兴奋性神经元转变为皮层脑区的抑制性神经元（扩展数据图4）。接下来，作者测试了胶质细胞是否也在不同大脑区域之间存在转录差异。作者为每种主要胶质细胞类型识别了多个转录上不同的子集，并确定了它们的特征标记基因（图2a和补充图20-25）。在胶质细胞类型中，星形胶质细胞具有最高的区域异质性，包含了高度富集于新皮质（GRM3+DPP10+）和丘脑（LUZP2+DCLK1+）的亚型（图2a-c和补充图20）。特定区域的星形胶质细胞亚型通过RNA原位杂交实验验证（图2d），并通过分析一个独立的snRNA-seq数据集得到确认（补充图23m）。皮层星形胶质细胞富含参与谷氨酸处理和转运的标记物，而海马体和前丘脑富集的DCLK1星形胶质细胞谷氨酸转运体活性较低，反而富含与粘着斑相关的基因（图2c和补充图25a）。丘脑星形胶质细胞（LUZP2+）在GABA摄取基因SLC6A1和SLC6A11的表达水平上比其他亚型高得多，尽管在丘脑中抑制性神经元的比例并没有显著增加（图2c）。值得注意的是，丘脑MEIS2+FOXP2+内神经元与新皮质GRM3星形胶质细胞共享多个标记物，包括GRM3、MEIS2和VAV3，这表明在进化上较新的区域中的星形胶质细胞可能与较老区域中的抑制性神经元共享一些功能。
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图2. 星形胶质细胞在基因表达模块注释区域的多样性。
作者开发了一种名为单细胞去相关模块网络（scdemon）的方法，用于在图谱规模的snRNA-seq数据集中从高度相关的基因集中识别基因表达模块（图2e）。在单细胞数据集中，细胞类型组成的高度不平衡，其中稀有的细胞状态被常见的细胞类型所超过，可能导致基因-基因相互作用的恢复不足，特别是对于低水平表达的基因。为了解决这些问题，作者的方法估计了一个样本去相关的基因-基因相关矩阵，根据它们的稀疏性阈值基因-基因对，并使用调整后的矩阵来识别高度相关的基因模块（方法）。作者使用此方法在图谱中的所有细胞以及每个主要细胞类型独立地识别模块，并恢复了不同程度表达的模块，范围从每个胶质细胞类型的标识模块到仅在0.7%的小胶质细胞中发现的细胞周期模块（图2f，扩展数据图5，补充图26-36和补充表6）。表达这些模块的细胞在作者数据集中丰富多样，包括细胞亚型身份（205个模块）、大脑区域（156个，其中77个特定于丘脑，34个特定于内嗅皮层）、AD状态（73个）、APOE基因型（78个）和性别（24个）（图2f和补充表7）。作者对细胞类型进行了层次聚类模块，并发现许多细胞类型表达了胆固醇生物合成（C10）、分子伴侣（C5）、核糖体（C1和C2）、内质网蛋白处理（C7）、氧化磷酸化（C18）、突触相互作用（C16）以及糖酵解和对缺氧的反应（C20）的基因程序（扩展数据图6a,b）。使用这种方法，作者在星形胶质细胞中识别了32个模块，包括一个在超过99%的星形胶质细胞中表达的星形胶质细胞广泛程序（M9，以GPM6A和GPC5为标志，并富含细胞连接组装），以及亚型和区域特异性的身份程序，如与丘脑相关的M19（SLC6A11、LGR6、MRAS），这些程序富含音猬因子信号传导，M12（GRM3：前脑神经元发育）和M7（DCLK1：突触膜）（图2g,h和补充图31）。其他模块涵盖了一系列不同的功能，包括金属稳态、RNA剪接、糖酵解、氧化磷酸化和胆固醇生物合成，并被多个亚型共享（图2i-k和扩展数据图5b和6a-c）。例如，富含分子伴侣和APOE-ε4相关的M8在多个不同的星形胶质细胞亚型和区域中表达，而与AD相关的M28（金属稳态）的表达与APOE+（M0）和反应性（M3）星形胶质细胞的表达重叠（图2i-k）。跨样本的模块-模块相关性揭示了共同表达的程序，如反应性星形胶质细胞（M3，以TPST1、CLIC4和EMP1为标志）与胆固醇生物合成模块M17（r = 0.60），以及糖酵解（M6）与AP-1模块M13（r = 0.39，包括FOS/JUN和泛素），这对在代谢应激下的星形胶质细胞中可能共同表达（扩展数据图6d,e）。与星形胶质细胞相比，免疫细胞显示出很少的区域特异性，而少突胶质细胞系细胞具有丘脑富集的亚型，与新皮质富集的亚型相比，转录组差异较小（补充图21-25）。免疫模块包括身份程序，如T细胞（M6）、巨噬细胞（M7）和循环小胶质细胞（MKI67+，M5），以及在免疫细胞中发现并富含参与NF-κB信号传导（M18）、干扰素（M20）、p53和DNA损伤反应（M22）和TGFβ信号传导（M14）的基因的模块（扩展数据图6f和补充图32）。少突胶质细胞系模块显示出高度的区域特异性，两个OPC模块——丘脑富集的M11和内嗅皮层富集的M25——被标记为与突触相关的基因，如与神经粘附相关的SEMA3D、SEMA6D和CNTN5，以及谷氨酸受体GRIA4，这表明OPC感觉和对特定大脑区域神经元活动的响应（扩展数据图5c,e和补充图33,34和36）。在构建了跨越AD受影响大脑区域的图谱后，作者检查了AD如何影响细胞组成。在主要细胞类型层面，作者观察到兴奋性神经元（OR = 0.94，按AD病理诊断分层的个体）、抑制性神经元（OR = 0.93）和OPCs（OR = 0.85）的数量略有非显著性减少，以及少突胶质细胞（OR = 1.14，调整P（Padj）= 0.01）和血管细胞（OR = 1.24）的数量增加，主要由EC、HC和PFC区域的差异驱动，尤其是在晚期AD中（扩展数据图7a,b）。接下来，作者测试了与AD病理和临床诊断以及区域NFT和斑块积累相关的区域特异性神经元亚型的比例是否显著改变（图3a和扩展数据图7c,d）。在兴奋性神经元中，作者识别了一个HC特异性（CA1锥体神经元）和四个EC特异性（L2 RELN+外侧EC，L3 RELN+，L5和L2/3 TOX3+TTC6+神经元）亚型，在病理诊断为AD的个体中显著较少（OR = 0.38–0.66）（图3a和补充图37a-c）。新皮质L2-3神经元在NFT水平高的样本中也显著较少，在具有新皮质NFT参与的个体中也是如此（图3a）。具有这些易受损兴奋性神经元亚型比例较低的个体在认知任务中表现显著较差，其中对情景记忆和整体认知功能的最强影响是标记有GPC5的亚型（EC L5和L2 RELN+）（扩展数据图7e,f）。值得注意的是，尽管整体兴奋性比例与认知无关，但在区域和特别是非新皮质区域中OPC比例较低显著与认知障碍相关（补充图37d）。
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图3. 阿尔茨海默病亚型特异性神经元易感性。
鉴于这些神经元亚型位于高度相互连接的区域，作者接下来检查了跨区域连接的神经元亚型是否协调性地减少。作者发现，在AD患者中，易受损的神经元亚型特别被共同消耗，一些最强效应观察到在CA1、下托、EC-L3和EC-L5之间已建立的连接中（图3b,c和扩展数据图7g）。这些包括内侧L5与投射到L5的下托（Kendall的相关系数τ=0.37（AD）; -0.1（非AD））或CA1（τ=0.42（AD）和-0.16（非AD））的共同消耗；以及CA1与L2侧EC（LEC，τ=0.26（AD）和-0.07（非AD））和L3 RELN+（τ=0.24（AD）和-0.13（非AD））EC神经元的共同消耗，这两种神经元部分投射到CA1亚区（图3b,c和扩展数据图7g）。接下来，作者调查易受损亚型是否共享可能介导其脆弱性的标记基因，并鉴定了391个基因，在易受损亚型中有显著更高的基线（非AD）表达（图3d和补充表8）。这些包括Reelin信号通路基因RELN和DAB1；与激酶相关的基因MAP2K5、PRKCA和SPHKAP；以及与肝素硫酸蛋白多糖生物合成相关的多个基因（包括HS6ST3、XYLT1和NDST3）（图3d和扩展数据图7h,i）。值得注意的是，虽然RELN表达通常仅限于抑制性神经元，但在两个EC兴奋性亚型中高度特异性，但其下游伴侣DAB1在亚型中普遍存在（扩展数据图7h,i和补充图37e,f）。接下来，作者使用来自621名ROSMAP研究参与者的单细胞转录组，检查PFC中易受损的抑制性神经元亚型是否与作者大脑区域中的易受损兴奋性神经元亚型共享特征。作者鉴定了在有高缠结密度负担的个体中被耗尽的特定抑制性神经元亚型，这与作者之前的发现一致（扩展数据图7j）。易受损和非易受损的抑制性神经元亚型在神经元投射形态发生（ROBO2、SEMA6A和EPHB6）、酶联受体蛋白信号通路（FGFR2、TGFBR1和PLCE1）以及肝素硫酸蛋白多糖生物合成方面的基因表达不同（扩展数据图7k和补充表8）。值得注意的是，易受损的抑制性神经元亚型表达了显著更高水平的Reelin信号通路组分RELN和DAB1，与作者在易受损兴奋性神经元亚型中观察到的这两种基因表达水平更高相呼应（图3e）。此外，Reelin受体LRP8（也称为ApoER2）和NRP1在易受损与非易受损的抑制性神经元亚型中的基线表达显著不同（图3f）。为了测试AD中表达Reelin的兴奋性神经元的选择性脆弱性，作者在AD患者和无AD的健康个体的EC组织样本中进行了原位杂交（RNAscope）分析Reelin和vGlut（兴奋性神经元标记）。作者发现，在AD个体的EC中表达Reelin的兴奋性神经元百分比显著减少（图3g）。为了确定这一发现是否在AD的动物模型中保守，作者使用免疫组织化学评估了12个月大的App敲入（KI）小鼠和9个月大的Tau（P301S）转基因小鼠的EC中Reelin的表达。作者发现，与野生型同窝小鼠相比，App-KI小鼠和Tau（P301S）小鼠的EC中Reelin阳性神经元的百分比显著减少（图3h,i），这与作者的人类转录组数据一致，表明表达Reelin的神经元选择性脆弱（图3d–f）。为了理解易受损亚型在AD中是如何改变的，作者计算了每种兴奋性神经元亚型的差异表达基因（DEGs）（方法和补充图38a–c）。作者将DEGs划分为与易受损或非易受损亚型相关的集合，根据它们在晚期AD个体中的表达水平（扩展数据图7l,m）。与非易受损亚型相关的DEGs富集于多种功能，包括泛素连接酶结合、热休克蛋白家族分子伴侣、内质网蛋白处理和神经元死亡介质，而与脆弱性相关的DEGs仅高度富集于线粒体氧化磷酸化，但包括与Reelin信号相关的CRK和NEUROD217,18（扩展数据图7l,m和补充图38d–f）。一些与非易受损亚型相关的DEGs在易受损亚型中具有更高的差异效应大小，并显示对有氧糖酵解（包括PGK1、LDHB和SLC2A3）和clathrin介导的内吞作用（包括AP2M1/AP2S1、OCRL和COPS8）的额外富集（扩展数据图7m）。为了确定病理性AD个体中细胞表达和功能的特殊区域差异，作者计算了每个主要细胞类型在每个区域单独以及跨区域的差异表达基因（DEGs），调整了已知的协变量和潜在的未知批次效应（方法）（扩展数据图8a和补充表9）。星形胶质细胞和抑制性及兴奋性神经元在所有区域中显示出DEGs数量最多，变化最大的在EC（扩展数据图8a）。值得注意的是，神经元DEGs在区域间几乎没有重叠，表明AD中神经元的差异主要由亚型或起源区域决定（扩展数据图8b）。相比之下，小胶质细胞和OPC DEGs在非新皮质区域内部重叠，而星形胶质细胞和少突胶质细胞的变化在所有区域中更为一致（扩展数据图8b）。AD DEGs与已发表的结果一致，既包括特定区域的DEGs，也包括针对多种AD变量计算的所有区域的DEGs，并通过与各种独立研究的比较进一步证实11,12,15,19,47,48,49,50,51,52,53（补充图39）。兴奋性DEGs在所有区域中强烈富集于电子传输功能项，并显示出蛋白质折叠、泛素化和突触相关项的微弱区域特异性富集（扩展数据图8c）。抑制性DEGs也在所有区域中广泛富集于蛋白质折叠和突触相关项，以及在丘脑中独特的氧化磷酸化（扩展数据图8c）。虽然小胶质细胞DEGs广泛富集于clathrin包被内吞作用（上升）和病毒反应（下降），但它们也有多种区域特异性富集，包括在EC和HC中MHC-II结合的上调，丘脑中的RNA处理以及PFC和EC中的糖酵解；以及HC驱动的吞噬作用、磷脂酶信号和蛋白激酶活性的下调（扩展数据图8c）。大多数区域特异性DEGs要么广泛共享（平均而言，11%的基因在区域中的3种以上细胞类型中差异表达），要么在细胞类型特异性程序中（40%的DEGs在细胞类型的3个以上区域中）（扩展数据图8d,e）。这样的基因包括SLC38A2和EIF4G2（在区域中广泛共享）和PRDX5、HLA-DRA或CD44，分别是兴奋性神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中上调的DEGs（扩展数据图8f和补充图40）。跨细胞类型广泛共享的基因显示出区域特异性富集，包括EC中的DNA损伤、HC中的淀粉样β结合和铁转运以及上调基因中的糖酵解，以及下调基因中的磷脂生物合成和自噬（扩展数据图8e）。基于PFC中全球AD病理负担的DEGs的基因集在每个区域和胶质细胞类型中跨全球病理一致变化，表明胶质细胞AD反应的显著组成部分在区域间是一致的（扩展数据图8b–e和9a,b）。其余的区域DEGs（平均而言，48%的DEGs）突出了区域和细胞类型特异性变化。在小胶质细胞中，这些包括在HC中上调的PPARG和MSR1，每个都与小胶质细胞极化有关，以及在EC中脂蛋白修饰剂APOC1的上调和转录因子FOXP2的下调（扩展数据图8f和补充图40）。接下来，作者检查了哪些细胞类型和区域在使用单细胞疾病相关性评分（scDRS）计算的GWAS评分中最丰富。小胶质细胞和免疫细胞在区域中始终得分很高，最高分是HC、丘脑和AG中的小胶质细胞TPT1+亚型和巨噬细胞（扩展数据图9c）。作者检查了GWAS基因是否显示出与AD进展的区域特异性相关的表达区域特异性差异。作者鉴定了在小胶质细胞中表达区域特异性的八个GWAS基因，包括PLCG2（EC）、APOE和SORL1（丘脑）以及MS4A4A（中颞叶皮层）（扩展数据图9c–f）。为了确定GWAS鉴定的基因是否与阿尔茨海默病的病理学有区域关联，作者将区域病理测量的DEGs与149个已确定的家族性AD和GWAS位点基因相交（扩展数据图10和11a）。作者发现74个基因（49%）至少在一个细胞类型中差异表达，多个基因显示出区域特异性表达，包括脂质转运蛋白ABCA7（在丘脑中富集）、锌指蛋白ZNF655（EC）和补体受体CR1（新皮质）（扩展数据图10）。GWAS和家族性AD基因在小胶质细胞中表达最高（75个基因）并且差异表达（30个基因），25个基因至少在三种细胞类型中差异表达，包括上调的CLU、PLCG2和SORT1，以及下调的DENND6A（扩展数据图10）。在所有细胞类型中，星形胶质细胞和小胶质细胞在高神经炎斑块密度区域的这些基因中显示出最大的差异变化，例如对于APOE、HLA-DRA、PILRA和SORT1，并且对弥漫性斑块的反应最大。神经元和少突胶质细胞系细胞在这些基因中显示出更强的差异，包括PLCG2、CLU和MAF，在高NFT密度区域（扩展数据图10）。为了确定不同的病理学是否诱导不同的转录反应，作者计算了区域特异性的NFT和神经炎性淀粉样β斑块负担的DEGs（除丘脑外，每个区域都进行了测量）（图4a, 扩展数据图11a,b和补充图41）。AD病理的DEGs与病理学诊断的DEGs高度重叠（NFT: 平均45%和斑块: 53%）（图4a）。NFT和斑块DEGs之间的一致性在EC和HC中对所有细胞类型最高（平均调整后的R2分别为67%），在PFC（43%）和AG（21%）中最低，这与新皮质中晚期AD NFT的出现一致（图4b）。
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图4. 基因表达模块注释和分离AD病理变化。
接下来，作者鉴定了在NFT或神经炎性斑块中表现出更大差异效应的基因（图4c、扩展数据图11c–f和补充表10）。一致地，与NFT相关的基因（374个基因，在两种以上的细胞类型中差异表达）包括PLCG2、CLU和CTNNA2（在少突胶质细胞和OPCs中表达）以及线粒体亚基，并且这些基因富集于内质网蛋白处理、电子传输和钙粘蛋白结合功能（图4d,e）。与神经炎性斑块相关的基因（190个基因）包括调节能量稳态的基因IRS2、PDK4和HIF3A，以及与免疫反应、染色质调节和脂滴相关的基因。值得注意的是，在兴奋性神经元中，与斑块相关且上调的DEGs在有氧传输链组分中强烈富集（包括NDUFA4和COX6B1）（图4f,g）。另一方面，与NFT相关且下调的DEGs富集于三羧酸循环基因，而上调的DEGs则富集于未折叠蛋白反应和与溶酶体相关的基因。最后，星形胶质细胞相比其他细胞类型含有更多与斑块相关的DEGs，它们的病理学相关DEGs在作者的表达模块中富集，包括金属稳态（M28）针对斑块相关DEGs，氧化磷酸化（M27）和分子伴侣（M8）针对NFT相关DEGs（图4c,h–j）。有趣的是，反应性星形胶质细胞模块（M3）在斑块上调基因中富集，而在NFTs下调基因中富集（图4j）。鉴于NFT相关或斑块相关DEGs在表达模块中的富集，作者接着检查了基因模块是否富集了AD DEGs（针对AD病理或AD诊断）（图4k、扩展数据图11g和补充图42）。那些富集了病理学相关星形胶质细胞DEGs的相同模块也富集了全套DEGs，包括金属稳态（M28）与神经炎性斑块DEGs，氧化磷酸化（M27）与NFT DEGs（图4k）。包括细胞外基质、粘附和神经发生相关基因的模块在AD中明显降低（M1和M11），而特定星形胶质细胞亚型的模块（M7, DCLK1+; 和 M24, DPP10+）则富集了上调的DEGs（图4k）。作者独立地在多种细胞类型中鉴定了热休克分子伴侣、糖酵解和氧化磷酸化的模块，这些模块在细胞类型间相关，并富集了上调的DEGs（图4k、扩展数据图6a,b和11g以及补充图42a,b）。糖酵解模块在小胶质细胞和星形胶质细胞中的弥漫性斑块DEGs中富集，并共享了一组基因，包括规范的糖酵解基因（PDK1/3/4, PFKL/P, PKM和PGK1）、厌氧糖酵解酶（TPI1和LDHA）和应激诱导基因（EGLN1, DDIT4, VEGFA和BNIP3L）（图4k–m和扩展数据图6a,b）。所有胶质类型都上调了核心糖酵解驱动因子GAPDH和调节线粒体自噬的BNIP3L，以响应NFT负担，并在认知受损的个体中（图4m）。在高弥漫性斑块的区域，星形胶质细胞上调了将葡萄糖-6-磷酸转化为丙酮酸的糖酵解酶，同时下调了线粒体丙酮酸转运蛋白MPC1（图4n）。同时，星形胶质细胞独特地上调了DDIT4、PFKP和ADCY8，以及抑制脂肪酸代谢（ANGPTL4）和促进脂肪酸在脂滴中储存（HILPDA）的基因，而小胶质细胞则上调了多个与糖原相关的基因（GBE1, UGP2和PYGL）（图4m）。为了验证ADCY8和PFKP的差异表达，作者在AD患者和无AD的对照个体的AG组织样本中进行了原位杂交（RNAscope），发现这两种基因在AQP4+星形胶质细胞中的转录本显著增加（图4o,p）。最后，作者注意到糖酵解途径基因在每个区域的全球AD进展中在不同的时间点达到最高表达。该途径在EC中非常早地达到峰值（ABC评分为1，AD病理水平低），在HC和中颞叶皮层中较晚（中等水平），在PFC中非常晚（高水平）（补充图42c），表明胶质细胞对AD的代谢反应可能不是全局协调的。除了理解与AD中特定病理学测量相关的细胞改变，作者还调查了与AD中认知韧性相关的转录变化，即那些有AD脑病理的个体显示出比预期少得多的认知障碍的情况。为了鉴定可能赋予AD病理学认知韧性的分子介质，作者将认知韧性定义为无认知障碍的存在，尽管有AD的病理学诊断（临床诊断条件），或者作为观察到的认知与基于病理学水平预期的认知之间的差异。作者计算了基于整体认知功能的CR得分，以及基于整体认知功能变化率的认知衰退韧性（CDR）得分，并使用了四种不同的AD病理学测量方法：全球AD病理学、神经炎性斑块负担、NFT负担和缠结密度。
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图5. CR与AD病理的分子相关性。
作者在PFC的每种主要细胞类型中计算了CR（认知韧性）和CDR（认知衰退韧性）的DEGs（差异表达基因），数据来自427名ROSMAP研究参与者的snRNA-seq。星形胶质细胞是唯一一种在所有测试的测量中与CR相关基因数量持续高企的细胞类型。为了确定可能有助于CR的星形胶质细胞内特定分子途径，作者专注于在星形胶质细胞中与多种CR测量一致相关的基因（称为CR相关基因）。几种CR相关基因，包括GPX3、HMGN2、NQO1和ODC1（编码多胺生物合成的限速酶），具有抗氧化活性或促进抗氧化活性。在星形胶质细胞中，HMGN2、NQO1、ODC1和GPX3的表达也与认知功能呈正相关，这些基因在那些随时间认知衰退最少的个体的星形胶质细胞中表达最高。ROSMAP队列的大量RNA-seq数据分析（n=638）证实了HMGN2、ODC1和GPX3的表达水平与多种认知功能和AD病理的CR之间存在显著的正相关。此外，作者注意到星形胶质细胞中的几个CR相关基因编码催化参与胆碱形成和分解的代谢反应的酶。GCPD1的表达，它编码甘油磷胆碱磷酸二酯酶1，是一种关键的酶，负责切割甘油磷胆碱（GPC）以产生胆碱，与星形胶质细胞中的CR测量呈正相关。相反，PNPLA6编码一种磷脂酶，催化细胞内磷脂酰胆碱的水解，磷脂酰胆碱是一种主要的膜脂质，产生GPC，而CHDH编码胆碱脱氢酶，一种催化胆碱转化为甜菜碱醛的酶，两者都与星形胶质细胞中的多种CR测量呈负相关。在PFC星形胶质细胞中鉴定的许多CR相关基因也与大脑其他区域星形胶质细胞的CR相关，这证实了星形胶质细胞与PFC之外的CR之间的联系。为了验证胆碱途径基因PNPLA6、GCPD1和CHDH，作者选择了具有高淀粉样蛋白和tau病理学的个体的PFC样本，并比较了认知完好（即认知韧性）的个体与认知受损的个体之间的转录水平，并使用AQP4作为星形胶质细胞标记进行了这些基因的原位杂交（RNAscope）分析。作者发现，在认知韧性的个体中，PNPLA6和CHDH的转录本显著减少，而GCPD1的转录本显著增加，这与差异表达结果一致。值得注意的是，胆碱氧化成甜菜碱会生成一个活性甲基团，可以用于同型半胱氨酸的再甲基化，从而产生甲硫氨酸，后者随后转化为普遍的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸。S-腺苷甲硫氨酸参与了精胺的生物合成，将星形胶质细胞中的胆碱代谢和多胺生物合成与AD病理的CR联系起来。在这里，作者展示了一个老年人大脑的转录组图谱，它覆盖了48位被诊断出患有或没有阿尔茨海默病（AD）的个体的六个大脑区域。作者利用这个图谱来注释区域性细胞多样性，识别细胞类型间的基因表达程序和AD差异，并精确定位对AD敏感的特定区域细胞群体。作者提供了一个交互式网站，用于探索图谱以及这些注释、标记、功能模块和AD差异，这些都可以单细胞和伪大体水平上进行（网址为http://compbio.mit.edu/ad_multiregion）。本研究有几个局限性：等向性分数和读取深度的截止可能会根据它们的核内容而对细胞恢复产生偏见；核RNA可能无法完全捕获小胶质细胞状态或局部转录组变化；病理负担是基于每个样本的平均值，而不是每个细胞的空间环境。额外的个体和数据模式将加强未来对AD区域特异性变化的分析，空间数据可能有助于进一步区分与病理学相关的改变。Manolis Kellis博士，1999年在麻省理工学院（MIT）获得理学学士学位（BS），1999年在MIT获得工程硕士学位（MEng），2003年在MIT获得博士学位（PhD）。2004年至今在MIT电气工程与计算机科学系（Department of Electrical Engineering and Computer Science）陆续担任助理教授和副教授。课题组致力于通过对大规模功能和比较基因组学数据集的计算整合，进一步加深作者对人类基因组的理解。(1) 作者使用多个相关物种的比较基因组学来识别蛋白质编码基因、RNA结构、微RNA、调控基序和个体调控元素的进化特征。(2) 作者利用表观遗传修饰的组合来定义与不同功能相关的染色质状态，包括启动子、增强子、转录和抑制区域，每个区域都具有不同的功能属性。(3) 作者利用许多细胞类型中的功能元素的动态来将调控区域与其目标基因联系起来，预测激活因子和抑制因子，以及细胞类型特异性的调控作用。(4) 作者将这些进化、染色质和活性特征结合起来，大幅扩展非编码基因组的注释，阐明人类和小鼠基因组的调控回路，并重新审视以前未被表征的与疾病相关的变异，为它们可能的分子角色提供机理见解。https://compbio.mit.edu/#bannerhttps://www.nature.com/articles/s41586-024-07606-7如果您对脑科学传播感兴趣，或者期待通过撰写文献解读督促自己阅读和思考最新的文献，亦或者是您想通过撰写文献解读锻炼自己的科学写作能力，欢迎联系NeuExpress编辑部，联系方式：
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