分裂内含子介导的蛋白质反式剪接以表达大型的肌营养不良蛋白撰稿：奚笛
校审：NeuExpress_北林
如何在基因治疗中表达大型的蛋白，特别是针对杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）这类疾病。
2023年7月17日，华盛顿大学医学院的Hichem Tasfaout教授和Jeffrey S. Chamberlain教授等人在Nature期刊发表了标题为“Split intein-mediated protein trans-splicing to express large dystrophins”的研究论文。该研究主要开发了一种新方法，利用分裂内含子介导的蛋白质转剪接机制，以表达大型的肌营养不良蛋白（dystrophins）。研究团队通过使用腺相关病毒（AAV）载体传递两个或三个片段，这些片段在肌肉细胞内通过蛋白质转剪接高效地组装成大型的midi-dystrophin或全长蛋白。这项技术有望为杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）及其他由大基因突变引起的疾病提供新的基因治疗策略。
杜氏肌营养不良症（DMD）是由编码肌营养不良蛋白的2.2兆碱基基因发生功能丧失性突变引起的，是最常见的人类遗传性疾病之一。在肌肉中，肌营养不良蛋白以427kDa的蛋白质形式表达，对保护细胞免受机械应力至关重要，并通过为多种蛋白质提供支架来调节几种细胞内信号传导途径。肌营养不良蛋白的缺失导致坏死和再生周期、进行性肌肉萎缩、炎症浸润以及最终的心肺衰竭。为了开发DMD的基因疗法，作者和其他人先前已经生成了“微肌营养不良蛋白”（µDys）构建物，这些构建物足够小，可以通过腺相关病毒（AAV）载体传递。尽管如此，这些微蛋白（大约是全长肌营养不良蛋白的33%）缺乏关键功能域，在动物模型和患者中显示出不完全的表型恢复。这些结果表明，表达具有改善功能的较大肌营养不良蛋白可能导致更强大的治疗。为了通过两个或三个AAV的共同传递生成更大的肌营养不良蛋白，已经测试了几种方法。使用同源重组或DNA转剪接，包含部分肌营养不良蛋白序列的AAV基因组可以在肌肉内重新组装，以编码更大的蛋白质。然而，这些基于DNA的方法显示出降低的效率，并依赖于向量基因组以特定方向的连接。此外，形成了由向量串联体引起的不需要的产物，这可能使它们在临床上的应用复杂化。另一种方法则依赖于使用分裂内含子来连接两种蛋白质。分裂内含子是小多肽，它们经历一种称为蛋白质转剪接（PTS）的独特翻译后自我处理事件，在该事件中，侧翼的N-和C-末端残基（外含子）自发地连接成一种功能性蛋白质，同时去除重组的内含子。这些遗传元素已成功应用于许多生物学应用，包括蛋白质纯化和标记步骤，以及最近在涉及大基因的视网膜或肝脏疾病中的基因替代。作者在这里鉴定了几对有效的内含子，可以通过双重或三重AAV载体管理后重组成高度功能性的中肌营养不良蛋白（midi-Dys；∆SR5–15）或全长肌营养不良蛋白（Dp427）。重要的是，这种方法不需要增加总载体剂量，并且导致与使用µDys获得的相同或更高的表达水平。使用最近发布的肌动蛋白AAV载体，作者展示了这些更大的肌营养不良蛋白可以在肌肉中使用明显低于目前DMD临床试验中正在测试的剂量来生成。作者展示了在年轻和非常老的营养不良mdx4cv小鼠的条纹肌肉中，使用这些更大的肌营养不良蛋白可以纠正多种功能缺陷，这些比使用当前µDys载体获得的更优越。这些分裂内含子构建物、肌动蛋白AAV的肌动蛋白血清型和强大的肌肉特异性启动子的联合使用有潜力显著增加DMD基因治疗的治疗影响，以及由大基因突变引起的其他疾病。已经鉴定了30多种分裂内含子。然而，大多数研究都是在纯化的蛋白质上进行的，这使得很难推断体内应用。另一个问题是，所有内含子高度依赖于在原始外含子（宿主蛋白）中发现的相邻残基来催化最终的连接。这些残基由外含子的N-和C-末端两半的最后和第一个三肽序列共同定义。为了使用PTS过程重组任何感兴趣的蛋白质，这六个残基必须包含在外含子/内含子边界中，并作为“足迹”留下，这可能会改变蛋白质的功能。为了比较它们的效力，作者生成了一个包含23种超快分裂内含子的库。该库被分为两个子组：第一组包括19种具有高序列同源性的分裂内含子，包括六个残基足迹，而第二组包含四对独特对。作者开发了一个分裂绿色荧光蛋白（GFP）系统，以对不同的分裂内含子对进行多步筛选。GFP具有桶状的三维构象，具有几个连接环，可以容纳多达十个氨基酸的插入，而不会严重干扰蛋白质的折叠，因此其荧光（扩展数据图1a，见原文）。作者评估了β-折叠之间的两个位点对最多八个残基插入的耐受性。尽管在人类胚胎肾293（HEK293）细胞中表达这些嵌合体构建物导致比野生型（WT）GFP更低的荧光强度，但第二个位点（Glu172-Asp173）比第一个位点（Gln157-Lys158）更允许八个残基的插入，具有几乎一个对数更高的荧光（扩展数据图1b，c，见原文）。因此，作者使用第二个位点将GFP切割成两个片段，并插入分裂内含子以筛选它们的PTS活性。对于每个内含子，克隆了两个质粒，其中N-或C-末端一半与GFP单体内联插入。此外，生成了带有六个残基足迹插入的相应GFP，并用作对照。所有质粒都转染到HEK293细胞中，以监测GFP荧光。尽管重组GFP发出的荧光比WT GFP低，但与GFP足迹对照记录的值相当（扩展数据图1d，见原文）。在第一组中，测试的19种分裂内含子中有6种显示出高连接效率，而在第二组中，三对内含子将两个GFP半部分连接成功能性GFP。第二次筛选是使用了这九对分裂内含子，以确定N-末端分裂内含子对其C-末端伙伴的特异性。由于AAV的包装能力有限（不超过5千碱基对），全长肌营养不良蛋白（Dp427）的表达将需要同时管理三个编码N-末端、中间和C-末端片段的载体，这些片段必须通过两对分裂内含子精确地重新组装。作者发现第一组的分裂内含子特异性较差，并与同一组的不同内含子发生了交叉剪接，这反映在变化的GFP荧光信号中（扩展数据图1e，见原文）。相比之下，第二组的分裂内含子对同一内含子的另一半表现出高度的特异性，并且没有与其他任何分裂内含子发生交叉剪接。这些结果揭示了第一组对的特异性不足，并强调了分裂gp41.1、IMPDH和Nrdj1的正交性，提示了可能同时使用它们来连接多个片段而不产生不需要的产物。基于这些数据，作者从第一组中选择了分裂Aha，从第二组中选择了gp41.1、IMPDH和Nrdj1进行进一步测试。在第三次筛选中，作者试图最小化由内含子剪接产生的六肽足迹。作者测试了几种组合，包括从分裂内含子/GFP连接体的N-或C-末端一半逐步删除一个残基（扩展数据图1f，见原文）。使用分裂Aha时，三残基连接体（N-末端侧的AEY）与原始AEY/CFN（N-末端侧的AEY和C-末端端的CFN）具有相同的剪接效率。同样，使用gp41.1时，GY/S替换SGY/SSS获得了有效的GFP连接。因此，这两个分裂内含子留下的足迹是三个残基而不是六个。对于分裂IMPDH和Nrdj1，足迹甚至更短，分别只有G/S和C/S。这些结果确定了所选择的分裂内含子的灵活性，并揭示了在连接的蛋白质中留下最小的足迹'疤痕'的同时获得相似的PTS活性。预先选择的分裂内含子的小尺寸提供了使用两个AAV传递和表达大型midi-Dys的可能性。这里作者使用了5′-克隆，编码从N-末端域到谱系样重复（SR）19末端的序列，但不包含SRs 5–15，以及3′-克隆，编码从Hinge3到C-末端域的序列。通过分裂内含子介导的PTS融合这两个片段，可以产生一个大型midi-Dys (∆SR5–15)，包含肌营养不良蛋白序列的68%，具有四个铰链、13个SRs、N-末端肌动蛋白结合域、nNOS定位域、一个假定的心脏保护域、富含半胱氨酸的域和整个C-末端域，其中一些在µDys中缺失（图1a和扩展数据图2，见原文）。此外，肽序列分析显示，位于SR19和Hinge3之间的四个分裂位点（GpS1、GpS2、GpS3和GpS4）部分匹配了上面确定的gp41.1最小足迹（扩展数据图2，见原文）。为了测试这些选项，HEK293细胞转染了要么表达整个midi-Dys ∆SR5–15的对照质粒，要么编码N-或C-末端分裂内含子/midi-Dys的双重质粒。Western blot分析显示，重组的midi-Dys出现在约291 kDa处的一个强带上（见图1b）。此外，分裂内含子方法产生的表达比单一∆SR5–15质粒获得的高出5-8倍，可能由于大型和小质粒之间的转染效率差异。当使用分裂位点GpS2和GpS4时检测到最高的表达（见图1b）。这一观察结果反映了所选择的分裂位点的效力和优化分裂gp41.1的效果。作者接下来测试了使用两个分裂内含子连接三个片段以表达全长肌营养不良蛋白的可能性（图1c和扩展数据图3，见原文）。由于分裂gp41.1在SR19和Hinge3之间显示出有效的连接，它被保持在这个位置，用于连接中间片段到C-末端片段。分裂Aha、IMPDH和Nrdj1被比较它们在SR7和SR8之间不同位置连接N-末端片段到中间片段的能力（扩展数据图4a–d，见原文）。每种分裂内含子的效力被单独评估，最初使用两个构建体来重组全长肌营养不良蛋白。HEK293细胞被共转染这两种质粒：一个表达与分裂内含子一侧融合的肌营养不良蛋白的三分之一，第二个质粒编码剩余的三分之二的肌营养不良蛋白，并与分裂内含子的另一半融合。蛋白表达分析显示，在预期的分子质量（约400 kDa）处，IMPDH、Nrdj1或gp41.1（但不是Aha）在不同位置插入时，都出现了强带（扩展数据图4e，见原文）。最后，IMPDH、Nrdj1和gp41.1在两种组合中被同时评估，使用三重载体方法。在第一种组合full-Dys1中，IMPDH被用来连接N-末端部分到中间片段，而在full-Dys2中，使用了Nrdj1。在两种情况下，分裂gp41.1被用来连接中间部分到C-末端片段（扩展数据图4f，见原文）。HEK293细胞被转染不同的条件（单独或双重质粒作为对照，或三重质粒测试同时PTS）。蛋白表达分析显示，两种组合都导致了表达一个强带，大约427 kDa，比控制全长质粒高出2到4倍（图1c）。这些数据展示了通过两个有效的分裂内含子介导的同时PTS，从三个质粒稳健地重组整个全长肌营养不良蛋白的可行性。![]()
图1. 利用肌营养不良蛋白序列对所选分裂蛋白进行体外验证
为了在体内验证这些构建体，每种组合的分裂肌营养不良蛋白/内含子克隆体被克隆到肌肉特异性增强子/启动子CK8e下游并打包成伪AAV6载体。作者在3周龄的肌营养不良蛋白缺失mdx4cv雄性的胫骨前肌（TA）中，以1:1的比例注射了5×10^10个不同对的病毒基因组（vg）。注射后5周，收集了治疗的肌肉进行分析。使用C-末端抗血清，在治疗的肌肉中检测到一个强大的midi-Dys带，大小为291 kDa（图2a,b）。第二个带大约在150 kDa，代表未剪接的C-末端片段，占检测到产物的50-70%（图2a,c）。使用midi-Dys2时，这两个带的表达明显更高，最终产物的表达是原来的四倍（图2b），表明蛋白片段的稳定性更高，分裂gp41.1在分裂位点GpS4插入时PTS效率高。使用针对N-或C-末端片段的抗体对肌肉横截面进行免疫标记，显示这些蛋白片段在肌膜上的共定位（图2d）。值得注意的是，单独注射片段导致它们在肌膜上的表达，没有任何明显的不良影响（扩展数据图5a,b，见原文）。重要的是，调整N-末端与C-末端载体的比例能够实现midi-Dys2的相似表达，并在组织学上取得改善，同时消除了C-末端片段的过量表达（扩展数据图5c–e，见原文）。同样地，当使用三重载体组合full-Dys2进行肌肉内注射时，显示出了全长肌营养不良蛋白的强表达，其水平大约是WT肌肉中内源性肌营养不良蛋白水平的九倍（图2e,f）。还检测到大约150 kDa的其他条带（这代表了未融合的C-末端片段，在full-Dys1中表达为67%，在full-Dys2中表达为33%），以及在同时给予中间和C-末端片段的条件下，大约在260 kDa和280 kDa处检测到两个中等大小的条带（图2e,g）。后者很可能是中间片段与C-末端片段融合的结果。分子大小的轻微差异（约30 kDa）可能对应于在不同的剪接步骤中有无重组的gp41.1内含子的形式。重要的是，在仅注射N-末端和C-末端片段的肌肉中没有检测到更多条带，这证实了分裂gp41.1对IMPDH或Nrdj1的正交性。使用针对N-末端、中间或C-末端片段的抗体对肌肉切片进行三重免疫染色，显示所有三个组分都位于肌纤维的外围（图2h）。一般肌肉形态学的分析显示，使用双重和三重载体策略，中心核肌纤维显著减少，分别约为30%，而对照组约为68%（图2h和扩展数据图5f，见原文）。这些数据证明了通过AAV介导的PTS在条纹肌肉中表达高度功能性的midi-Dys (∆SR5–15)或全长肌营养不良蛋白的优化分裂内含子在体内的功效。![]()
图2. 在mdx4cv小鼠体内验证AAV6分裂内含子/Dys结构
这种新方法的一个重要考虑是注入治疗性AAV剂量，同时不损害安全性。正在进行的肌肉骨骼疾病临床试验中注入的最大剂量约为2–3×10^14 vg·kg^-1（使用AAV血清型9或rh74）。为了测试使用系统性给药的分裂内含子方法的可行性，作者给8周龄的mdx4cv雄性通过血管内注入了2×10^14 vg·kg^-1的双重或三重AAV6载体的总剂量。对照组用单一AAV载体治疗，表达µDys5，目前正在对DMD患者进行评估（NCT03368742）。在注射后3个月，蛋白表达分析显示，midi-Dys的肌营养不良蛋白表达达到了WT水平的75%，full-Dys约为31%，而µDys5约为8%（图2i）在TA肌肉中。这些蛋白在心肌组织中更为丰富，三重载体输注后大约有62%的全长肌营养不良蛋白，双重载体策略产生的midi-Dys约为178%，单一µDys5载体约为66%（图2j）。通过TA和心脏切片的免疫标记确认了肌营养不良蛋白的表达（图2k和扩展数据图6a，见原文）。平均而言，在用双重或三重载体策略治疗的组中，大约40%的TA肌纤维对肌营养不良蛋白染色呈阳性，而表达µDys5的仅有约5%（图2k和扩展数据图6b，见原文）。相比之下，心脏切片显示了几乎每个心肌细胞中均匀且广泛的肌营养不良蛋白表达（扩展数据图6a，见原文）。此外，TA肌肉中肌营养不良蛋白的表达导致一般肌肉形态的适度改善，纤维大小和直径有所增加（扩展数据图6c,d）。这些数据支持了使用分裂内含子介导的PTS在条纹肌肉中表达大型肌营养不良蛋白的可行性。尽管如此，使用AAV6对这些成年mdx4cv小鼠进行注射，与心肌相比，后肢骨骼肌中肌营养不良蛋白结构的表达较低。这些观察结果很可能是由于AAV6在年轻成年小鼠的骨骼肌中的效力有限，这些小鼠正处于退化/再生危机之中，正如作者之前在给新生和青少年小鼠输注时获得的明显更高的表达水平。鉴于在成年小鼠胫骨前肌（TA）横截面中发现的肌营养不良蛋白的镶嵌表达，作者得出结论，以2×10^14 vg/kg的剂量系统性给予AAV6可能不足以确保在成年小鼠中均匀表达治疗水平的肌营养不良蛋白。因此，作者测试了最近描述的肌动蛋白AAV载体AAVMYO4。作为初步研究，使用低剂量2×10^13（总计）vg/kg和高剂量2×10^14（总计）vg/kg的AAVMYO，比较了单一（µDys5）和双重（midi-Dys2）载体策略。作为对照，使用AAV9传递µDys5。将AAV颗粒注入8周龄的年轻成年mdx4cv雄性小鼠的尾静脉。3个月后，对TA肌力的原位分析显示，低剂量AAV9 µDys5没有改善肌肉性能（图3a），而用低剂量AAVMYO µDys5处理的TA肌的特异性力显著增加（约41%）与生理盐水组相比；然而，无论是µDys5组都没有显示出显著的保护作用，防止收缩引起的损伤（图3b）。令人鼓舞的是，用低剂量AAVMYO双重（midi-Dys2）载体处理的mdx4cv小鼠显示出TA特异性力的正常化至WT值，并显著保护免受收缩引起的损伤。在使用高剂量AAVMYO的组中，无论是单一（µDys5）还是双重（midi-Dys2）载体策略，都发现了机械特性的类似正常化。此外，血清肌酸激酶水平分析显示，用低剂量双重AAVMYO处理的组与用生理盐水处理的对照mdx4cv相比，有轻微的减少，但用高剂量单一或双重AAVMYO处理的组显示出正常值（图3c）。相反，在用低剂量AAV9或AAVMYO µDys5处理的小鼠中，没有观察到血清肌酸激酶水平的改善。这些表型观察与µDys5和midi-Dys2的表达水平相关。在用低剂量AAV9处理的mdx4cv小鼠中没有检测到肌营养不良蛋白的表达（图3d），而用AAVMYO处理的组显示出µDys5和midi-Dys2的强表达。当给予高剂量AAVMYO载体时，µDys和midi-Dys2的表达水平至少是原来的两倍。类似的观察结果通过免疫荧光染色发现，在用低或高剂量AAVMYO µDys5或midi-Dys2处理的小鼠的TA横截面中，分别约有80%和98%的肌纤维对肌营养不良蛋白呈阳性，而用AAV9处理的约有10%的肌纤维呈阳性（扩展数据图7a,b，见原文）。µDys5或midi-Dys的表达也恢复了α-肌糖蛋白和β-肌营养不良蛋白的定位（扩展数据图7a）。使用µDys5或midi-Dys2的两种剂量都显著改善了一般肌肉形态。然而，只有用midi-Dys处理的TA肌显示出中心核肌纤维的百分比减少和肌纤维面积和直径的正常化（扩展数据图7c–e）。其他条纹肌，如膈肌和心脏，在用低或高剂量AAVMYO处理的组中显示出均匀的肌营养不良蛋白染色，导致纤维大小和直径显著增加（扩展数据图8c,d）。与后肢肌类似，肌营养不良蛋白的表达水平在使用更高剂量的组中在膈肌和心脏中都增加了一倍（扩展数据图8e,f，见原文）。总体而言，这些数据证明了AAVMYO在传递µDys5或分裂midi-Dys2组分方面的优越性。成功组装大型midi-Dys (∆SR5–15)与低剂量输注AAVMYO载体后的µDys相比，显示出显著的表型改善。图3. 全身给药AAVMYO分裂蛋白/天增强肌肉靶向低剂量
尽管缺乏肌营养不良蛋白，年轻的mdx小鼠只发展出轻微的营养不良表型。然而，随着年龄的增长，表型逐渐恶化，导致严重的膈肌功能障碍、心肌病和更大的骨骼肌损伤，伴有明显的纤维化。为了探索分裂内含子载体方法是否可以保护和/或逆转这些缺陷，17个月大的mdx4cv雄性小鼠用2×10^13 vg/kg的总剂量AAV9或AAVMYO治疗了7个月，以表达µDys5或midi-Dys (∆SR5–15)。在用AAVMYO处理的组中，在TA、腓肠肌和比目鱼肌中发现了肌营养不良蛋白的稳健表达，作者观察到约60%的肌纤维对肌营养不良蛋白呈阳性；相比之下，AAV9导致了约5%的µDys5转导（图4a,b和扩展数据图9a–d和10a–c，见原文）。肌肉组织学分析显示，未经处理的17个月大和生理盐水注射的24个月大的mdx4cv小鼠，以及低剂量AAV9-µDys5组的肌肉高度纤维化和浸润。在AAVMYO µDys5 mdx4cv组中发现了肌肉形态的显著改善，但在用双重AAVMYO处理的小鼠中注意到更大的改善（图4a,c和扩展数据图9a,e和10a,d，见原文）。进一步的组织学分析显示，所有AAV处理组的中心核肌纤维百分比很高（约40%），但在表达µDys5或midi-Dys2的肌肉中，肌纤维面积和直径略有增加，表明中间肌肉重塑。然而，TA肌显示出显著的保护作用，防止损伤（图4d）。用双重AAVMYO处理的组显示出TA特异性力的正常化至WT水平（图4d,e），而µDys5组在使用低剂量的AAV9或AAVMYO时未能显示出明显的改善。![]()
图4. 在非常年长的mdx4cv小鼠中，长期表达midi-Dys2可将骨骼肌缺陷逆转至WT水平。
对分离和灌注心脏的评估显示，midi-Dys2与µDys5相比具有更优越的保护作用。用双重AAVMYO处理的mdx4cv小鼠的心脏在高钙浓度诱导的左心室功能高负荷反应中的表现与WT心脏没有差异（图5a,b和扩展数据图11a,b，见原文）。相比之下，两个µDys5组显示出缺陷保护。心脏横截面分析显示，两种AAV血清型都显示出肌营养不良蛋白的均匀表达和一般形态的改善，但只有midi-Dys2显著减少了纤维化（扩展数据图11c,d，见原文）。令人惊讶的是，在接受AAV9和AAVMYO治疗的mdx心脏中，µDys5蛋白表达没有差异，但观察到midi-Dys2的富集（图5c）。这可能表明大型midi-Dys2的半衰期更长或稳定性更强。这些观察结果与使用膈肌样本通过Western blot评估的蛋白表达一致，显示midi-Dys2表达强烈，而µDys5的量略低（图5d）。这导致了µDys5膈肌特异性力的适度增加，但与年龄匹配的生理盐水对照组和17个月大的组相比，双重AAVMYO（midi-Dys2）显著改善（图5e）。因此，大型midi-Dys的表达在老年营养不良心脏中导致了明显的保护作用和随时间的治疗改善，并显著保护了膈肌。实际上，mdx4cv小鼠在17至24个月大的组之间表现出明显的肌肉质量丧失，显著的肌纤维间浸润和胶原沉积以及更小的纤维（图5f和扩展数据图10g–j），正如之前所注意到的。相比之下，AAVMYO递送防止了肌肉消耗，并导致了均匀的肌营养不良蛋白表达，纤维大小和直径，这增加了2岁营养不良小鼠的力量。
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图5. 双AAVMYO中天入路对老年mdx4cv小鼠心脏和膈肌的保护作用。
使用AAV的基因替代方法对于DMD和其他一些疾病一直具有挑战性，部分原因是其有限的携带能力以及对非常高剂量的需求。在这项研究中，作者展示了通过将编码序列分割成两部分或三部分，由AAV运输，然后通过分裂内含子介导的高度特异性PTS机制有效地重新组装成大型功能性蛋白，表达大型基因的可行性。作者的结果表明，与µDys相比，大型肌营养不良蛋白在年轻和老年营养不良小鼠的骨骼肌和心肌中具有更优越的治疗效果。值得注意的是，本研究中测试的midi-Dys2是可以通过管理两个AAV载体表达的最大的构建物，并不一定是最有效或最优的中等大小的肌营养不良蛋白。该构建物携带13个适当相位的SRs和所有四个铰链，以及整个N-末端肌动蛋白结合、富含半胱氨酸和C-末端域。England等人报告说，携带DMD基因46%（外显子17-48）缺失的患者基本上无症状，并在第七个十年仍然能够行走，同时表达高度功能性的小型肌营养不良蛋白。作者之前展示了通过适当相位SRs（∆H2–SR19）产生的略小的小型肌营养不良蛋白甚至比∆外显子17–48肌营养不良蛋白在mdx小鼠中更具功能性。虽然这项研究没有直接比较更大的midi-Dys (∆SR5–15)与较小的患者小型肌营养不良蛋白 (∆H2–SR19)，但与远小于µDys的midi-Dys (∆SR5–15)的数据暗示，表达一个具有进一步功能域的大型肌营养不良蛋白（图1）在表型结果和蛋白表达方面比远小于µDys更好。这可能是由于AAV生物分布、蛋白表达、PTS效率、生物力学功能和/或蛋白稳定性的差异。作者的数据还证明了将三个不同的肌营养不良蛋白亚片段融合以在条纹肌中使用两个非常特定的分裂内含子生成全长肌营养不良蛋白的可行性。通过分裂GFP系统对分裂内含子库的彻底多步筛选，允许识别可以同时使用而没有交叉剪接的几对。使用肌营养不良蛋白也验证了各种候选物的正交性。除了高效的分裂内含子对之外，骨骼肌中最佳基因重组还需要具有高肌肉特异性的强大AAV载体以及强大的肌肉限制表达载体。已经使用定向进化或DNA重组工程制造了几种新的肌动蛋白AAV载体。在这项研究中，作者证实了AAVMYO的优越性和高肌肉特异性，允许使用的剂量比DMD临床试验中使用的剂量低十倍。使用强效的CK8e组织特异性表达载体将表达限制在肌肉中，避免在其他器官（如肝脏）中的非目标表达，并进一步减少潜在的免疫反应（使用肌肉限制性启动子已被证明可以最小化转基因免疫反应）。在这项原理验证研究中，所有携带分裂内含子/肌营养不良蛋白的载体都以等摩尔比例给予，但每个组分的表达水平使用定性或半定量分析进行了评估。开发准确的测定方法以精确量化蛋白水平至关重要，以确定PTS发生前每个片段的表达功效和稳定性，并优化它们在管理的AAV混合物中的化学计量（扩展数据图5）。尽管如此，每个亚片段的相对表达水平也可以通过使用具有不同转录活性的调节载体来调整。最后，尽管作者的研究清楚地证明了分裂内含子和肌动蛋白AAV技术在年轻和老年mdx4cv小鼠以及骨骼肌和心肌中都带来了更大的功能改善，但需要进一步的调查来解决这种方法的安全性。首先，当前研究中使用的分裂内含子包含大约125-150个总氨基酸残基，所有这些序列都来自细菌，其细胞内半衰期未知。第二，每个蛋白半部分的表达，以及在患者细胞中包含残留内含子“足迹”的重组蛋白，可能会导致免疫反应。第三，外源性肌营养不良蛋白在肌营养不良蛋白缺陷细胞中的表达可能是免疫原性的，正如一些接受AAV-µDys治疗的DMD患者所报告的那样。涉及这种免疫反应的区域被映射到围绕Hinge1的区域。无论这种反应是由于Hinge1本身还是由于H1/SR1到µDys的其他相邻序列的非自然连接引起的，目前尚不清楚。尽管内含子生成的midi-Dys (∆SR5–15)包含Hinge1，但它与正常肌营养不良蛋白中连续的序列并置，这可能会降低暴露免疫显性表位的风险。总体而言，这项工作解决了基于AAV的基因替代的重要限制，并提出了一种新方法，以低于目前DMD临床使用的载体剂量高效地表达大型和高度功能性的超大型蛋白。这种方法可以用于许多其他涉及超过AAV载体包装能力的大基因的疾病。Jeffrey Chamberlain 博士是神经病学、医学和生物化学系的教授，华盛顿大学医学院肌肉萎缩症McCaw特聘教授，西雅图参议员 Paul D. Wellstone 肌肉萎缩症合作研究中心主任。Jeffrey Chamberlain实验室专注于了解和开发肌肉萎缩症和其他肌肉疾病的治疗方法。这些研究以Duchenne肌营养不良(DMD)基因(dystrophin)为中心，探讨这些基因与LGMD2I基因(FKRP)的表达和功能。一个主要的重点领域涉及到将肌营养不良蛋白或其他基因传递到肌肉进行基因治疗的载体的发展。正在测试这些载体的安全性以及它们停止和/或逆转营养不良表型的能力。正在研究的主要载体来源于腺相关病毒(AAV)，它能有效地将基因转移到骨骼肌和心脏。目前正在开发用于全身全身输送的方法，并且正在计划进行人体临床试验。另一个研究领域是研究肌肉干细胞及其在体外基因治疗中的潜在用途，这些基因治疗是用慢病毒载体转导细胞，或使用AAV进行直接基因校正。作者将基因转移到肌肉上的努力也被用于治疗遗传性和非遗传性肌肉萎缩疾病。https://sites.uw.edu/chamblab/原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07710-8如果您对脑科学传播感兴趣，或者期待通过撰写文献解读督促自己阅读和思考最新的文献，亦或者是您想通过撰写文献解读锻炼自己的科学写作能力，欢迎联系NeuExpress编辑部，联系方式：
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