撰稿：奚笛
校审：NeuExpress_北林
杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）的基因治疗。
2024年7月21日，Indiana University School of Medicine的Renzhi Han教授在Nature Communications杂志发表标题为“Systemic delivery of full-length dystrophin in Duchenne muscular dystrophy mice”的研究论文，该研究主要开发了一种三重载体系统，用于将全长抗肌营养不良蛋白（FL-dystrophin）有效传递到杜氏肌营养不良症（DMD）小鼠的骨骼肌和心肌中，从而显著改善肌肉组织病理、收缩功能和整体力量。
杜氏肌营养不良症（DMD）是一种致命的遗传性疾病，大约每3800至6300例活产男婴中就有1例受到影响，由位于X染色体上的DMD基因发生遗传突变引起。DMD基因编码的肌营养不良蛋白属于细胞骨架蛋白的谱系蛋白超家族。在横纹肌中表达的主要亚型是一种427 kDa的蛋白质，包含四个主要结构域：N-末端肌动蛋白结合域、由谱系蛋白重复组成的长杆状域、富含半胱氨酸的域，该域与肌糖蛋白和其他膜相关蛋白结合，以及与合成蛋白和α-肌营养不良蛋白结合的C-末端域，形成大型肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物（DGC）。DGC将肌动蛋白细胞骨架与细胞外基质连接起来，促进力的传递，提供机械稳定性和膜保护，并介导信号转导。肌营养不良蛋白表达的破坏导致肌肉损伤和修复的循环，最终耗尽肌肉干细胞的再生能力，导致纤维化和脂肪替代。骨骼肌、心肌和呼吸肌中肌肉质量和功能的逐渐丧失最终导致活动能力受损、心肌病、呼吸衰竭和早逝。使用腺相关病毒（AAV）的基因替代疗法可以递送正确的DMD基因副本，允许恢复肌营养不良蛋白以停止/逆转肌肉的恶化。然而，AAV的有限载货能力（约4.5 kb）使得递送全长DMD基因（cDNA超过11 kb）具有挑战性。早期研究发现，携带DMD基因大段内部缺失的患者发展出一种较轻的疾病形式，称为贝克尔肌营养不良症（BMD），这是由于表达截短但部分功能的肌营养不良蛋白。这些发现促成了微肌营养不良蛋白（μDys）基因疗法的发展，该疗法旨在恢复肌营养不良蛋白截短版本的表达。这些肌营养不良蛋白的缩小形式仅约占全长肌营养不良蛋白的1/3，保留了蛋白质的一些基本功能域，并且可以被包装到一个AAV载体中进行体内递送。这种方法在临床前动物模型中显示出前景，恢复了肌肉完整性并改善了肌肉功能。最近，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了Sarepta的Elevidys（在AAVrh.74中递送的μDys）用于4至5岁的DMD患者。然而，由于缺少包含与肌营养不良蛋白复合物中其他蛋白结合所需的关键杆状和铰链域的2/3肌营养不良蛋白编码序列，这些μDys基因疗法无法为骨骼肌和心肌的完整性和功能提供全面保护。这种局限性凸显了开发新策略以递送更大甚至全长肌营养不良蛋白的迫切需求。已经探索了使用双AAV载体递送更大有效载荷的几种不同方法，包括基因组片段组装、重叠、反剪接和混合方法。例如，包含重叠片段以表达大型转基因的两个载体可能会经历同源重组。然而，同源重组的效率在共同递送时是这一策略的限制因素。另一种称为反剪接的方法是利用AAV的自然串联能力，使用双AAV载体扩大转基因大小。然而，头对尾串联形成和跨ITR连接的前mRNA的反剪接构成了速率限制步骤。这些方法可以如混合载体系统所示进行组合。尽管这些双AAV载体策略在临床前研究中取得了不同程度的成功，但现有双载体系统的表达效率对于许多临床基因治疗应用来说是不够的。递送全长肌营养不良蛋白序列更具挑战性，这大约是AAV包装能力的三倍，因此需要至少三个载体来包装整个编码序列。以前使用三重反剪接AAV载体的尝试显示了表达全长肌营养不良蛋白的可行性，尽管效率非常低。1. 分裂内含子构建的的概念验证设计，以组装全长肌营养不良蛋白全长肌营养不良蛋白的cDNA超过11 kb，大约是AAV包装能力的三倍。因此，需要三个AAV载体来包装全长肌营养不良蛋白的整个编码序列。作者根据（1）片段大小、（2）蛋白质域结构和（3）分裂内含子的连接序列兼容性，合理地将FL肌营养不良蛋白cDNA分割成三个片段。作者之前利用Cfa32和Gp41-133，两种具有非常快速蛋白质反剪接（PTS）速率的正交内含子，成功组装了腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。因此，作者选择这两对正交内含子进行初步测试。第一个分裂位点选择在谱系蛋白重复（SR）8和9之间，那里一个半胱氨酸残基后面是一个笨重的色氨酸残基，正如Cfa内含子高效蛋白质剪接所要求的（图1a）。第二个分裂位点选择在铰链3（H3）域的末端，那里有两个连续的丝氨酸残基，这可能有助于Gp41-1内含子介导的蛋白质剪接（图1a）。此外，这也是天然Dp140亚型开始的地方。作者称这个第一版中的三个片段构建为Dys-N1、Dys-M1和Dys-C1。所有表达载体都使用带有肌肉肌酸激酶增强子（meCMV）的小型CMV启动子。将Dys-N1/M1/C1转染到HEK293细胞中，结果表达的FL肌营养不良蛋白可以被三种不同的特异性识别N、M或C片段的抗肌营养不良蛋白抗体检测到（图1b）。然而，FL肌营养不良蛋白带比未组装或部分组装的肌营养不良蛋白片段要弱得多。改变三种质粒的比例提高了FL与未组装或部分组装肌营养不良蛋白信号的相对丰度，N1:M1:C1质粒的4:2:1比例产生了最高水平的FL肌营养不良蛋白。C末端片段带比FL或MC带要强烈得多，表明需要改进由Gp41-1内含子介导的M和C片段之间的组装。![]()
图1. 用于组装FL -肌营养不良蛋白的分裂蛋白结构的设计和试验
2. 优化分裂内含子构建以提高FL肌营养不良蛋白组装受到这一初步观察结果的鼓舞，作者尝试优化M和C片段之间的组装。首先，作者测试了H3域内的一个不同的分裂位点（IGA-SPT），并将-1位点的丙氨酸突变为酪氨酸，以有利于Gp41-1介导的PTS（图2a）。这些变化（Dys-M2和Dys-C2）导致FL肌营养不良蛋白组装的大幅改进（图2b、c），未组装的（图2d-f）和部分组装片段减少（补充图1a-c，见原文）。此外，作者去除了C片段构建中的一个小内含子（Dys-C3），这显著增加了FL肌营养不良蛋白带强度（图2b、c）。接下来，作者推断外显子（例如，Dys-C3）上的+1到+3位点也可能影响PTS效率。因此，作者在C片段构建的连接位点上将SPT序列突变为SSS（图2g）。此外，考虑到C片段的丰度，作者将强Kozak序列换成了弱的。然而，这两个变化（Dys-C4）导致FL肌营养不良蛋白带的大幅减少，并增加了NM带和C带的积累（图2h-l和补充图1d-f，见原文）。作者推断这可能是由于使用了弱Kozak序列，这可能导致从下游的框架内起始密码子开始翻译，从而使C片段在没有内含子融合的情况下表达。的确，当作者在这版C片段构建中将弱Kozak序列换回强的时（Dys-C5），FL肌营养不良蛋白表达恢复了（图2h-l和补充图1d-f，见原文）。值得注意的是，作者还在Dys-C5构建中添加了一个合成的泛素依赖性蛋白水解信号（PB29），以降低C片段的表达水平。尽管与Dys-C3相比，FL肌营养不良蛋白带信号有所降低，作者观察到NM片段几乎无法检测到，表明这些变化改善了NM和C的组装。作者进一步测试了不同的内含子（IMPDH−1），它具有与Gp41-1相当的快速PTS速率，并且具有GGG-SIC的天然连接序列，类似于肌营养不良蛋白的分裂位点（IGA-SPT）（图2m）。作者还将Dys-M2外显子的-1位点的丙氨酸突变为甘氨酸，以进一步模仿IMPDH-1的天然连接序列。这些变化（Dys-M3和Dys-C6）显著提高了FL肌营养不良蛋白信号约86%（图2n，o）。此外，与Dys-N1/M2/C5相比，未组装的C片段带显著减少了约76%（图2n，r），对未组装的N和M片段（图2n，p，q）和部分组装片段（补充图1g-i，见原文）的影响较小。最后，作者在起始密码子的上游插入了两种不同的聚腺苷酸信号序列，以进一步降低C片段的表达水平（Dys-C7和Dys-C8）（补充图2a，见原文）。这些变化显著降低了C片段带强度，同时仍保持高水平的FL肌营养不良蛋白表达（补充图2b，c，f）和类似的N/FL（补充图2d）或MC/FL比率（补充图2i，见原文）。然而，作者发现进一步降低C片段表达会导致M（补充图2e，见原文）和NM（补充图2g，h，见原文）片段的同时积累。这些数据表明，C片段的一些过量有利于FL肌营养不良蛋白的组装。与典型的内含子不同，也发现了具有小内含子N和大内含子C的非典型内含子。为了测试这些非典型内含子是否也能使全长肌营养不良蛋白（FL-dystrophin）组装，作者使用非典型内含子Cat和VidaL分别修改了N、M和C构建，以介导N-M和M-C剪接（补充图3a，见原文）。Western blotting分析显示，这些非典型内含子也可以促进FL肌营养不良蛋白的组装，但效率远低于Dys-N1/M3/C6（补充图3b，见原文）。作者选择了最佳优化版本Dys-N1/M3/C6进行进一步的体内研究。![]()
图2. 组装FL-肌营养不良蛋白的分裂蛋白结构优化
3. 在系统性MyoAAV递送Dys-N1/M3/C6后，mdx4cv小鼠中FL肌营养不良蛋白表达的恢复作者首先将通用启动子meCMV替换为合成的肌肉特异性启动子Spc5-124（用于N和M片段构建）或Spc2-264（用于C片段构建），用于AAV包装。作者选择了最近工程化的肌动蛋白AAV衣壳MyoAAV4A进行包装，因为它在系统递送后在小鼠和猴子中具有优越的肌肉和心脏转导能力。将由N1、M3和C6组成的2E + 14 vg/kg AAV载体以2:1:1的摩尔比通过视网膜下注射递送到一组mdx4cv小鼠（N = 13）中，这些小鼠在3-4周龄时接受治疗（图3a）。使用前述的抗肌营养不良蛋白抗体进行免疫荧光染色（图3b）。可以在野生型（WT）腓肠肌（GA）肌膜上检测到肌营养不良蛋白表达，而mdx4cv小鼠的GA肌对这些抗体染色均为阴性（图3b）。AAV管理恢复了可以被这三种抗体检测到的肌营养不良蛋白表达（图3b）。重要的是，肌营养不良蛋白信号正确地定位在肌膜上，没有在细胞质中明显积累。平均而言，肌营养不良蛋白在83.4 ± 2.7%的肌纤维中被检测到（图3c）。在mdx4cv小鼠的心肌中，肌营养不良蛋白表达也得到了强有力的恢复，有78.3 ± 2.7%的心肌细胞在AAV管理后呈肌营养不良蛋白阳性（补充图4a，c，见原文）。然而，膈肌肌纤维中的肌营养不良蛋白+纤维（8.6 ± 2.6%）远低于GA肌中的肌营养不良蛋白+纤维（补充图4b，d，见原文）。还进行了Western blotting分析以证实这些观察结果。再次，使用三种不同的N-、M-或C识别抗体，在mdx4cv小鼠的GA肌中检测到FL肌营养不良蛋白（图3d）。有趣的是，N-和M-识别抗体主要检测到FL肌营养不良蛋白，部分组装的肌营养不良蛋白片段很弱，而未组装的N-或M-片段几乎无法察觉（图3d）。C-识别抗体检测到的FL肌营养不良蛋白和未组装的C片段的强度大致相等，而部分组装的MC片段几乎无法检测到（图3d）。在AAV处理的mdx4cv小鼠的心肌中也很容易检测到FL肌营养不良蛋白表达（补充图4e，见原文），但膈肌在AAV处理后显示出FL肌营养不良蛋白和C片段的表达明显较弱（补充图4f，见原文），可能反映了Spc2-26启动子和/或MyoAAV4A衣壳在膈肌中的活性较弱。肌营养不良肌肉中肌营养不良蛋白的缺失严重破坏了整个肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物（DGC）的完整性。为了测试AAV-N1/M3/C6治疗是否恢复了mdx4cv肌肉中DGC的其他组分，作者使用针对DGC各种组分的抗体进行免疫荧光染色，如α-肌糖蛋白（α-SG）、β-SG、α-肌营养不良蛋白（α-DG）、β-DG、神经型一氧化氮合酶（nNOS）和α-肌营养不良蛋白（α-DB）。如图3e所示，从mdx4cv小鼠的GA肌纤维的肌膜中严重减少的DGC组分，包括α-SG、β-SG、α-DG、β-DG、nNOS和α-DB，都通过AAV-N1/M3/C6治疗得到了显著恢复。![]()
图3. MyoAAV4A系统递送Dys-N1/M3/C6后mdx4cv小鼠FL -肌营养不良蛋白表达的恢复
4. mdx4cv小鼠在系统性MyoAAV4A递送Dys-N1/M3/C6后的功能性和组织病理学改善肌肉损伤增加和肌肉力量产生减少是DMD的病理特征。为了检验AAV-N1/M3/C6治疗是否改善了mdx4cv小鼠的肌肉病理状况，作者首先在AAV给药后5周测量了血清肌酸激酶（CK）水平。与WT小鼠相比，mdx4cv动物的血清CK显著升高（WT：220.6 ± 109.1，n = 14对比mdx4cv：3946.0 ± 341.1，n = 12；p < 0.0001，图4a），在AAV治疗组显著降低（1060.0 ± 229.4，n = 13；p < 0.0001），这表明FL-肌营养不良蛋白的表达减少了营养不良小鼠的肌肉损伤。为了测试AAV-N1/M3/C6治疗是否改善了肌肉功能，作者使用体内肌肉测试系统测量了肌肉收缩性。在150 Hz的胫神经超最大电刺激期间测量了最大跖屈张力。如前所示，与WT对照组相比，mdx4cv小鼠产生的扭矩大大减少（WT：544.7 ± 9.8，n = 8对比mdx4cv：298.2 ± 10.6，n = 10；p < 0.0001，图4b）。AAV-N1/M3/C6的系统递送显著增加了mdx4cv小鼠的张力约51.7%（452.5 ± 12.0，n = 11；p < 0.0001，图4b）。为了检验AAV-N1/M3/C6治疗是否改善了mdx4cv小鼠的组织病理学，作者对动物的骨骼肌切片进行了HE染色。虽然WT GA肌肉切片显示正常的肌肉结构，但mdx4cv小鼠显示出典型的肌营养不良表型，表现为中心核肌肉纤维（CNFs）、肌肉坏死和再生的存在。这些病理特征通过AAV-N1/M3/C6管理得到显著改善（图4c）。为了进一步量化CNFs的百分比，作者使用抗laminin α2和DAPI对肌肉切片进行了免疫荧光染色（图4c）。mdx4cv小鼠的GA肌肉中的CNFs通过AAV-N1/M3/C6治疗从58.2 ± 1.7%减少到25.1 ± 1.5%（图4d）。由于退化和再生的循环，mdx4cv GA的肌肉纤维大小分布转移到比WT更小的尺寸（图4e），而AAV-N1/M3/C6治疗将纤维大小分布转移到WT肌肉的大小（图4e）。AAV-N1/M3/C6治疗似乎也改善了mdx4cv膈肌的组织病理学，但作者没有观察到膈肌中的CNFs显著变化（补充图5a-b，见原文），这与AAV处理的mdx4cv膈肌中肌营养不良蛋白恢复较低一致。为了检验AAV-N1/M3/C6治疗对纤维化的影响，作者在肌肉切片上进行了Masson三色染色，这表明mdx4cv小鼠的GA（图4c，f）和膈肌（补充图5c-d，见原文）肌肉中的纤维化通过AAV-N1/M3/C6治疗大大减弱。![]()
图4. 全身MyoAAV4A递送Dys-N1/M3/C6后mdx4cv小鼠功能和组织病理学改善
Spc2-26启动子在膈肌中可能不高效工作，因此在这种组织中FL-肌营养不良蛋白的恢复较低。为了测试这一点，作者将C构建物中的启动子更换为Spc5-12，并将AAV-N1/M3/C6-Spc5-12指定为AAV-FL-v2，原始的AAV-N1/M3/C6指定为AAV-FL-v1。两种AAV混合物（N、M和C载体的总剂量为2E + 14 vg/kg，比例为2:1:1）通过视网膜下注射系统地施用于一组mdx4cv小鼠。在AAV注射后6周，动物被处死进行检查。Western blotting分析显示，AAV-FL-v1和AAV-FL-v2在GA肌肉中的FL肌营养不良蛋白表达水平相当（图5a-d）。为了估计与健康骨骼肌中内源性肌营养不良蛋白相比，恢复的FL肌营养不良蛋白的相对量，对照人类骨骼肌裂解物在凝胶上加载了50%，25%和10%。三种不同的抗体识别N、M或C片段，分别报告了AAV-FL-v1和AAV-FL-v2治疗后FL肌营养不良蛋白恢复的32.6-49.5%和36.9-43.4%（图5b-d）。在膈肌肌肉中，与AAVFL-v1相比，AAV-FL-v2治疗显著增加了FL肌营养不良蛋白的表达，通过抗M和C抗体检测（图5e-h）。在心肌中观察到FL肌营养不良蛋白恢复的类似改善（图5i-l），表明Spc5-12启动子在膈肌和心肌中比Spc2-26更有效。值得注意的是，由于作者无法获得人类膈肌和心肌样本，作者使用人类骨骼肌裂解物来估计膈肌和心肌中FL肌营养不良蛋白恢复的相对量。由于作者使用的MyoAAV的总剂量相对较高（2E + 14 vg/kg），作者想知道较低的总剂量（8E + 13 vg/kg，N、M和C的比例为2:1:1）是否能在mdx4cv小鼠中实现有效的FL肌营养不良蛋白恢复。正如图5a-d所示，在使用较低剂量治疗的GA肌肉中可以轻易检测到FL肌营养不良蛋白，尽管与高剂量组相比水平较低。低剂量组和高剂量组之间的差异在膈肌肌肉（图5e-h）和心脏（图5i-l）中不太明显。![]()
图5. 启动子和剂量对mdx4cv小鼠骨骼肌和心肌中FL -肌营养不良蛋白表达的影响
5. 在mdx4cv小鼠中比较MyoAAV传递的全长和微型肌营养不良蛋白最后，为了与微型肌营养不良蛋白基因治疗进行基准比较，作者对MyoAAV传递的全长和微型肌营养不良蛋白基因传递在mdx4cv小鼠中进行了比较研究。测试了两种不同的微型肌营养不良蛋白构建体，一种类似于辉瑞版本但包含谱系重复（SR）2和22的融合（指定为µ-v1），另一种最初在段的实验室开发（指定为µ-v2）（图6a）。所有肌营养不良蛋白构建体都受到Spc5-12启动子的控制。AAV-µ-v1和µ-v2以8E + 13 vg/kg的剂量传递，而AAV-FL-v2的总剂量为2E + 14或8E + 13 vg/kg（由三个片段中最低剂量确定的有效剂量为5E + 13或2E + 13 vg/kg）。与图5中显示的数据一致，AAV-FL-v2在高剂量组传递后，FL-肌营养不良蛋白在GA肌肉中恢复到正常人类骨骼肌水平的46.3%（图6b，c），然而，微型肌营养不良蛋白蛋白在AAV-µ-v1和µ-v2传递后分别过表达3.7和2.6倍（图6b，c）。同样，AAV-FL-v2传递导致在膈肌中FL-肌营养不良蛋白恢复到10.0%，在心脏中恢复到69.3%（以人类骨骼肌为参考），而微型肌营养不良蛋白在膈肌和心脏中分别过表达2.6–7.8倍（补充图6a–d，见原文）。为了检查肌肉纤维中FL-肌营养不良蛋白和微型肌营养不良蛋白蛋白的表达，作者在GA肌肉的一个切片上进行了抗N（10F9，识别铰链1区域）和抗M（8773R，仅识别人类肌营养不良蛋白的SR16/17）的共免疫荧光染色，并在连续切片上进行了抗N和抗C（Ab15277，识别C末端）的共免疫荧光染色。如图6d所示，WT骨骼肌对N和C抗体呈阳性，但对M抗体没有预期的阳性反应，而mdx4cv骨骼肌对这些抗体仅显示背景信号。AAV-µ-v1仅对N抗体产生阳性染色，而AAV-µ-v2导致N和M抗体均呈阳性。用AAV-FL-v2治疗的mdx4cv小鼠对所有三种抗体均呈阳性，信号正确地定位在肌膜上。有趣的是，通过视觉检查荧光图像，很少发现任何肌肉纤维仅对一种或两种抗体呈阳性（例如，如果一个肌肉纤维对一种抗体呈阳性，它也对其他两种抗体呈阳性）在接受AAV-FL-v2治疗的mdx4cv小鼠中。为了进一步说明这三种抗体信号之间的高度相关性，作者对这些图像进行了线剖面分析。如图7补充图所示，N和M免疫荧光信号在三个任意选择的线上显示出几乎相同的模式。同样，N和C免疫荧光信号也显示出高度重叠的峰值。这些结果表明，仅表达未组装或部分组装的肌营养不良蛋白片段的肌肉纤维非常罕见，如果有的话。所有AAV处理组的血清CK水平显著降低，µ-v1和µ-v2组接近WT水平（图6e）。与对照mdx4cv小鼠相比，所有治疗组的肌肉收缩力显著增加，且治疗组之间没有显著差异（图6f）。作者进一步进行了悬挂线测试，以评估这些小鼠的整体肌肉力量。记录并比较每组动物的跌落时间。平均而言，WT小鼠在网状线上停留超过555.1 ± 30.4秒（n = 8），而mdx4cv小鼠仅停留215.4 ± 51.6秒（n = 4；p = 0.0002，图6g）。值得注意的是，所有AAV治疗完全使网状线上的悬挂时间正常化（AAV-FL-v2：542.1 ± 35.2秒，n = 5；AAV-FL-v2-L：466.0 ± 60.8秒，n = 5；AAV-µ-v1：538.0 ± 56.2秒，n = 4；AAV-µ-v2：476.6 ± 52.6秒，n = 5；图6g）。组织学检查显示，所有AAV处理组的GA肌肉的肌营养不良特征显著改善（补充图8a）。CNF的百分比从mdx4cv的59.0 ± 2.3降低到AAV-FL-v2、AAV-FL-v2-L、AAV-µ-v1和AAV-µ-v2治疗组的21.7 ± 1.2、29.5 ± 1.6、23.4 ± 1.8和25.7 ± 2.9（图6h）。纤维化区域在AAV处理组中也显著减少，各组之间没有观察到差异（图6i）。在膈肌中观察到类似的组织病理学改善（补充图8b，见原文）。心脏切片的组织学检查显示所有组之间没有显著差异（补充图8c，见原文）。![]()
图6. MyoAAV在mdx4cv小鼠中传递FL-和微肌营养不良蛋白的比较
尽管组织病理学和功能检测显示AAV-FL-v2和微型肌营养不良蛋白的类似改善，但以前的研究表明，由于缺乏肌营养不良蛋白的C末端域，微型肌营养不良蛋白未能纠正肌营养不良小鼠心脏中与cavin相关的ERK信号传导缺陷。与此一致，作者的数据显示，mdx4cv小鼠和AAV传递的微型肌营养不良蛋白的心肌细胞中cavin-4的膜定位被破坏，没有纠正cavin-4的这种错位（图7a）。然而，AAV传递的FL-肌营养不良蛋白大大恢复了mdx4cv心肌细胞中cavin-4的膜定位（图7a）。在心脏应激/损伤的响应中，膜相关的cavin-4招募信号分子ERK到洞穴膜以激活关键的心脏保护反应。Western blotting分析显示，mdx4cv小鼠心脏中ERK磷酸化被抑制，这不受微型肌营养不良蛋白基因传递的影响，但通过FL-肌营养不良蛋白基因传递显著改善（图7b–d）。综合这些数据，这些数据表明FL-肌营养不良蛋白基因治疗优于微型肌营养不良蛋白基因治疗。
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图7. MyoAAV递送的FL-dystrophin恢复了mdx4cv小鼠心肌中cavin-4的膜定位及其相关的ERK信号传导
AAV载体的小包装能力限制了DMD（杜氏肌营养不良症）和其他许多疾病的基因替代疗法。到目前为止，向全身肌肉输送全长肌营养不良蛋白尚未成功。在这里，作者利用分裂内含子介导的蛋白质三元系统（PTS）开发了一种三重AAV系统，用于高效组装和体内输送FL-dystrophin（全长肌营养不良蛋白）。使用工程化的肌动蛋白AAV衣壳，作者在骨骼肌和心脏中实现了系统性的FL-dystrophin救援，这在mdx4cv小鼠中导致了显著的功能、组织病理学和生化信号传导的改善。作者使用两种正交分裂内含子（Cfa和Gp41-1或IMPDH-1）与非常快的PTS速率，证明了在体外和体内生成FL-dystrophin蛋白的可行性。经过一系列优化构建设计（例如选择分裂内含子、分裂位点、添加降解信号、突变连接氨基酸等），作者逐步提高了组装效率。最佳版本（N1/M3/C6）可以在体外实现约60%的FL-dystrophin蛋白表达（相对于携带整个肌营养不良蛋白cDNA的质粒），并且未组装或部分组装产物的水平较低。早期使用Ssp DnaB分裂内含子组装6.3-kb Becker型肌营养不良蛋白和因子VIII的研究效率不高。这些结果表明，选择分裂内含子和肌营养不良蛋白上的分裂位点（因此连接氨基酸）对于高效FL-dystrophin组装特别重要。未来的努力可以系统地筛选不同的正交分裂内含子对，以进一步提高组装效率、表达和完全组装的FL-dystrophin蛋白的纯度。此外，作者优化的三重载体系统可以很容易地适应使用双载体输送大中型肌营养不良蛋白。N和M构建的分裂位点靠近Dp260亚型的自然起始位点，而M和C构建的分裂位点与Dp140亚型的起始位点重叠。选择这些分裂位点可能有助于最小化未组装的C和部分组装的MC片段的潜在负面影响。先前的研究表明，Dp260（MC片段）恢复了肌膜和肌纤维膜之间的稳定关联，组装了DGC，并显著减缓了mdx小鼠的肌营养不良进展。Metzger及其同事表明，NtermDys片段（对应作者的NM片段）不与肌营养不良蛋白竞争，没有病理效应，但2A蛋白酶切割的CtermDys（对应作者的未组装C片段）在转基因小鼠中过表达时足以引起心肌病。然而，在他们的CtermDys转基因小鼠中，CtermDys的表达量超过FL-dystrophin的10倍以上（从参考文献47的图1b估计），而在作者通过AAV输送的小鼠中，未组装的C片段与FL-dystrophin产物大致相等（图5i）。因此，未组装的C片段在作者的三重载体输送中引起心肌病的可能性非常小。与此一致，作者在三重载体输送后的mdx4cv小鼠中没有观察到心脏纤维化的增加（补充图8c，见原文）。然而，重要的是要仔细研究这些未组装和部分组装产物在未来的长期影响。作者通过半定量评估每个载体携带的N、M和C片段以及通过Western blotting法在体外初步评估组装产物的摩尔比。N和M片段似乎比C片段更不稳定。作者观察到，与CatN融合的N片段的表达水平明显低于与CfaN融合的，表明在N构建的C末端融合的较大的CfaN有助于N片段融合蛋白的不稳定性。尽管作者在这项工作中的努力主要集中在优化内含子和分裂位点以及降低C片段的表达上，未来的研究可以针对提高N和M片段的稳定性，这可能会提高FL-dystrophin的表达水平。可以探索几种策略。首先，密码子优化可能有助于提高N和M转基因的表达。其次，在其末端添加内含子“笼子”可能有助于稳定无序的内含子N。第三，可以测试更强的增强子序列以驱动N和M的表达。在这项原理验证研究中，作者最初使用较弱的启动子Spc2-26来驱动C片段的表达，使用更强的Spc5-12来驱动N和M片段的表达。然而，作者发现膈肌中C片段和由此产生的FL-dystrophin的表达非常弱。Spc2-26的弱活性可能有助于膈肌中FL-dystrophin恢复的低效率。确实，当使用Spc5-12来驱动C片段表达时，作者观察到在膈肌和心肌中FL-dystrophin表达有所改善。需要进一步优化以增加膈肌中FL-dystrophin的表达。这可以通过测试不同的肌肉特异性调控盒，如DES、MYL11、SERCA1、CKM和FLNC来驱动每个片段的表达及其在AAV混合物中的比例。有效的DMD基因替代疗法需要具有强大肌肉特异性的AAV衣壳。最近通过AAV衣壳库的定向进化，包含在AAV9的可变区域VIII中插入七个随机氨基酸，工程化了肌动蛋白衣壳。这些工程化的肌动蛋白AAV衣壳共享一个常见的“RGD”基序，已知可与几种整合素异二聚体结合。在这项研究中，作者利用MyoAAV4A的高肌肉特异性，允许同时施用三种AAV载体，总剂量目前用于神经肌肉疾病的临床试验。值得注意的是，MyoAAV4A及其相关变体在小鼠模型和非人灵长类动物中进行了测试，突出了它们临床转化的前景。最后，作者对FL-dystrophin进行了比较研究，使用相同的MyoAAV4A衣壳和相同的Spc5-12启动子，比较了三重载体方法与微肌营养不良蛋白在mdx4cv小鼠中的效果。作者的数据表明，以相同总剂量（8E + 13 vg/kg）输送FL-dystrophin和微肌营养不良蛋白，实现了类似的功能和组织学改善水平，除了血清CK测量。血清CK水平在用微肌营养不良蛋白治疗的mdx4cv小鼠中被标准化到约WT水平，但在用FL-dystrophin治疗的小鼠中不太明显。在膈肌肌肉中，FL-dystrophin基因输送后的肌营养不良阳性肌纤维较少，显然有助于更高的CK读数。有趣的是，在WB检查中，FL-dystrophin在三重载体注射后表达在约30-50%的正常水平，而微肌营养不良蛋白在正常骨骼肌中表达约2.6-3.7倍（图6b，c）。总体而言，这些数据表明，即使FL-dystrophin表达水平较低，也可以提供与过度表达的微肌营养不良蛋白类似的保护水平。此外，FL-dystrophin表达可以恢复cavin-4的膜定位和有缺陷的ERK信号传导，这在心脏中不能通过微肌营养不良蛋白基因输送来纠正（图7）。作者设想，未来对启动子、衣壳和三重肌营养不良蛋白载体的内含子分裂的优化可以将FL-dystrophin表达带到全身骨骼肌和心脏，提供最大的保护。FL-dystrophin基因疗法的一个潜在问题是宿主对FL-dystrophin及其与内含子融合产物的非自身表位的免疫反应，特别是在携带大片段缺失的患者中。最近的一项研究报告称，来自Sarepta、Roche（使用Sarepta的载体）、Pfizer和Genethon的4个不同临床试验中的5名DMD患者，接受了三种不同的基因疗法产品，这些产品在AAV血清型、启动子和剂量上有所不同，显示出令人惊讶的类似严重不良事件，这表明对微肌营养不良蛋白蛋白的细胞毒性T细胞免疫反应。所有五名患者都有类似的大重叠缺失（外显子8到外显子21），这在微肌营养不良蛋白中存在。这突出了预防可能限制基因疗法效果并造成不可挽回伤害的免疫反应的紧迫需求。这种干预措施也可以适用于许多其他正在开发的治疗方法，例如基因编辑疗法（其中，细菌衍生的Cas9蛋白被输送）。虽然超出了这项研究的范围，但作者未来的努力将集中在研究潜在的免疫反应和减轻它们的方法。令人鼓舞的是，来自临床试验的一项最新研究表明，通过免疫调节剂的鸡尾酒（例如，利妥昔单抗加西罗莫司以及类固醇）可以预防对AAV基因疗法的抗体反应，以防止抗AAV抗体的形成。此外，通过肝脏基因转移可以诱导免疫耐受，这在动物和一名血友病A患者的凝血因子VIII研究中得到了支持。这些类型的免疫调节可以在未来进行测试，看看它们是否也可以诱导对FL-dystrophin基因疗法的长期免疫耐受。总的来说，作者的工作通过输送功能性FL-dystrophin，解决了当前基于AAV的DMD基因替代疗法的一个关键缺陷。分裂内含子介导的组装与强大的肌动蛋白AAV衣壳相结合，使FL-dystrophin恢复以及在肌营养不良小鼠中的功能、组织病理学和信号传导改善。未来的研究将需要提高表达水平并研究宿主对FL-dystrophin基因疗法的免疫反应。此外，这种方法可能潜在地被实施用于其他需要超过AAV包装能力的大基因载荷的疾病，如LAMA2、RYR1、DSP、FLNC、DYSF、OTOF、MYO7A和F8等。Renzhi Han博士，印第安纳大学医学院Herman B Wells儿科研究中心。Renzhi Han博士在北京大学获得了学士学位，并在西澳大利亚大学获得了博士学位，随后在爱荷华大学的霍华德·休斯医学研究所与Dr. Kevin P. Campbell进行了博士后培训。课题组研究主要集中在研究遗传性肌肉病，并开发腺相关病毒（AAV）载体和非病毒方法，以实现人类疾病如肌肉营养不良症和心血管疾病的持久矫正。Renzhi Han博士曾在多个编辑委员会任职，并向包括美国国立卫生研究院（NIH）在内的各种资助机构提供专业服务。他目前担任《Molecular Therapy》的副主编。Renzhi Han博士还获得了美国国立卫生研究院（NIH）的多项资助（R01HL116546, R01HL159900, R01HL170260, R21HL163720, 和 R01HL169976），支持他在基因治疗领域的研究工作。他也是Zhida Therapeutics的创始人。https://medicine.iu.edu/faculty-labs/hanhttps://www.nature.com/articles/s41467-024-50569-6如果您对脑科学传播感兴趣，或者期待通过撰写文献解读督促自己阅读和思考最新的文献，亦或者是您想通过撰写文献解读锻炼自己的科学写作能力，欢迎联系NeuExpress编辑部，联系方式：
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