一、背景
自2017年美国FDA批准第一款基因疗法，至2024年1月已批准11款基因疗法。基因治疗作为一种前沿的医疗技术，通过向患者体内引入正常基因以治愈疾病。根据治疗方式，基因治疗又分为体内治疗和体外治疗。
图1 基因治疗体内和体外方法
载体作为基因治疗的关键工具主要分为病毒载体和非病毒载体。其中，病毒载体引起高效的基因传递能力而收到广泛关注。目前已开发出多种病毒载体，包括腺病毒（Ad）、腺相关病毒（AAV）、逆转录病毒（RV）、慢病毒（LV）、单纯疱疹病毒（HSV）等。
表1 基因治疗中常用病毒载体的生物学特性
图2 三种病毒载体示意图
二、载体生产工艺概述
病毒载体的制备涉及多个步骤，主要包括病毒的生产、纯化和包装，其目的是获得高纯度、高活性的病毒颗粒，以便后续的治疗应用。
图3 病毒载体2000L规模生产工艺概述（Ad5）
病毒载体由于其复杂的结构和可能引发的免疫反应，纯化过程中需要更多地考虑保持其完整性和活性，而单抗纯化则更注重于提高纯度和降低杂质含量，下图对单抗和病毒载体纯化做出了简单的对比。
图4 单抗纯化与病毒载体纯化流程对比
三、收获和澄清
病毒载体的收获和澄清是生产过程中的关键步骤，不仅涉及到细胞和细胞碎片的去除，还可通过选择合适的深层过滤膜包，实现对HCP和HCD的有效去除，从而提高病毒载体的纯度和质量，降低后续纯化步骤压力。
对于收获而言，收获的时间和温度都有可能影响病毒的质量和稳定性。在较高的培养温度（37℃）下，许多病毒产品的稳定性不如在较低温度（4-25℃）下。因此，为了维持病毒颗粒的稳定性，可能需要在表达量达到峰值开始准备收获。收获时间的确定不仅要考虑表达量，还要综合考虑产品质量、细胞密度、细胞活力等多个因素。随着培养时间的延长，细胞活力可能下降，导致产生更多的聚体及HCP、HCD和细胞碎片等，增加后续纯化步骤难度和成本。除此之外，不同类型的病毒颗粒的释放机制不尽相同，也需在确定收货时间时纳入考察。
在进行收获时，无包膜病毒需要裂解细胞以提高收率。在实验室中，常使用反复冻融、均质机、超声和化学添加剂的方法来裂解细胞。在大规模生产中，化学添加剂是首要选择，通常通过添加低浓度的表面活性剂（如0.1% Triton X-100）来完成裂解。需要注意的是，添加表面活性剂可能会导致包膜病毒的失活，即使是无包膜病毒在更高的温度（如37℃）下也可能不稳定。同时，细胞裂解过程中会增加料液中的HCP、HCP及细胞碎片的数量，尽管通过深层过滤可以去除部分杂质，仍对后续的纯化步骤提出了更高的要求。
在澄清步骤之前，通常会使用核酸酶处理，将DNA大小降至200bp以下的同时降低料液粘度。研究表明，DNA可能与病毒形成DNA-病毒复合物，该杂质在纯化后期极难去除，而在纯化早期去除细胞碎片和DNA有助于阻止DNA-病毒复合物的形成。核酸酶的使用可以有效降低后续纯化步骤压力，但核酸酶在不同的温度、pH和盐浓度条件下的酶活差异较大，还需验证核酸酶在后续纯化步骤中的去除效果。
四、柱层析
亲和层析作为一种成熟的平台技术，已被广泛应用于生物制品的纯化过程。在病毒纯化中，亲和层析作为主要的捕获手段使用，与其他方法相比，亲和层析具有更高的纯化能力。然而目前市场上可用于病毒亲和层析的填料较少，同时不同血清型病毒的亲和力也不同，这也限制了亲和层析在病毒纯化中的应用。为了解决这个问题，研究人员正在开发新的可适应多种血清型的亲和填料，并尝试对病毒颗粒进行修饰以便病毒被特定的配体捕获。
离子交换层析作用层析（IEC）是病毒纯化中的常用技术。阴离子交换层析（AEX）是一种较为传统的病毒纯化方法，利用病毒的酸性等电点可在常用缓冲液pH下完成病毒与HCP、HCD等杂质的分离。阳离子交换层析（CEX）在低pH条件下能纯化多种AAV血清型。然而，病毒的载量仍然较低，可选择大孔径填料以增加病毒在填料中的扩散从而提高载量。
盐溶液有助于释放AAV，但高盐浓度可能会破坏病毒颗粒的完整性。因此疏水相互作用层析（HIC）虽然同样被应用于病毒载体的纯化，但其效果不如IEX。为应对病毒颗粒的复杂性，复合模式层析（MMC）也开始应用于病毒纯化中。羟基磷灰石层析作为MMC中的一种，已用于腺病毒和逆转录病毒的纯化。此外，科研人员仍在积极探索更多适用于病毒纯化的MMC配体，它们有望通过疏水和电荷相互作用的协同效应，更有效地结合并分离病毒颗粒。
在病毒载体复制过程中，可能形成空壳病毒。空壳病毒可能部分缺失基因组，也有可能不包含任何核酸。在下图中可以看到，蓝色箭头表示空衣壳，中心有明显染色；红色箭头表示满衣壳，已排除染色；白色箭头表示部分满衣壳，中心有模糊染色。
图5 AAV8冷冻电镜
在实验室阶段，常采用氯化铯密度梯度离心的方式去除空壳病毒。在生产中， IEC是目前最为广泛应用的大规模层析技术之一，该技术利用病毒颗粒的电荷差异来实现分离。但在操作过程中也面临一些挑战，如为了获得更好的分离效果，通常需要使用复杂的梯度，但此操作会增加成本及程序运行时间。MMC也同样可以用于空壳病毒的去除，特别是结合电荷和氢键相互作用的填料。
五、病毒去除
在开发病毒载体相关疗法时，确保产品的安全性是至关重要的，这其中包括有效潜在的外源性病毒污染。除病毒过滤器作为一种有效的物理拦截方法已广泛应用于蛋白类产品中，AAV作为一种常用的病毒载体，大小约为20nm，可以通过传统的除病毒过滤器进行病毒去除，但对于其他病毒产品，如Ad、LV等可能无法通过除病毒过滤器进行。低pH灭活在单抗纯化中通常用于包膜病毒的去除，但在病毒纯化中不适用于LV。
AAV的热稳定性使其可以通过热灭活来去除，这对于包膜和非包膜病毒颗粒都是有效的。然而，对于LV等包膜病毒，高温处理可能会破坏其结构，因此需要寻找其他的解决方案。
六、无菌过滤
无菌过滤是病毒载体生产的最后一道工序，它对于确保产品的无菌性至关重要。然而，病毒颗粒的大小通常大于蛋白质，这使得无菌过滤变得更加困难。膜材料的选择和优化对于减少非特异性结合和膜污染造成的病毒颗粒损失至关重要。
七、总结
基因治疗病毒载体纯化技术是基因治疗领域的一项关键技术，它直接关系到基因治疗的效果和安全性。虽然现有技术基本可以完成病毒纯化，但仍有提高纯度、活性的空间。新型填料和工艺的研发，以及生产流程的优化，将有助于提高病毒载体的质量和生产效率，为基因治疗的成功应用提供有力支持，推动该领域的持续创新和发展。
参考文献
[1] Singh N , Heldt C L .Challenges in downstream purification of gene therapy viral vectors[J].[2024-05-16].
[2]Barb,Thorne,Ryan,etal.GeneTherapy[J].AdvancesinBiochemical Engineering/biotechnology, 2017.
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