涉及基因组编辑的治疗干预需要将分子安全有效地输送到靶细胞核中。然而，目前的非病毒传递方法仅限于体外处理的细胞、经局部给药针对的组织或因肝脏对分子摄取的自然倾向。为了扩大体内基因编辑应用的范围，需要多种分子传递方法来实现对特定细胞或器官的内部传递。对病毒或病毒载体的趋向性进行重定向是一种成熟的递送策略，它涉及细胞选择性靶向分子的表面显示，以及通过在质膜或低pH环境中内体融合进入细胞所必需的病毒糖蛋白。VSVGmut-水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)的一种突变形式，它能保持内体融合活性，但缺乏天然低密度脂蛋白受体结合亲和力。
最近，2020年诺贝尔化学奖得主Jennifer A.Doudna教授在Nature Biotechnology上发表了名为“In vivo human T cell engineering with enveloped delivery vehicles”的文章。文中研究了一种名为Cas9-EDV的新型基因编辑载体，通过在EDV上将VSVGmut与抗体衍生的单链可变片段（scFv）配对，将Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物（Cas9-EDV）封装在内，可以实现体内外人类细胞特异性基因组编辑。
作者首先克隆了一种CD19靶向抗体，并且由于Cas9-VLP是从转染生产细胞的质膜上萌发从而推断共表达scFv融合物和VSVGmut以及对Cas9 RNP封装必需的慢病毒组分将产生具有受体特异性和内体逃逸能力的Cas9-EDV(图1a)。
为了分析Cas9-EDV的受体介导和多细胞类型的靶向工程化能力，作者生成了同时表达CD19和EGFP的HEK293T细胞系并制备了三种Cas9-EDV (图1b)。结果发现，在约3:1的HEK293T和CD19 EGFP 293T细胞混合物中，没有scFv配对的Cas9-EDV在CD19+和CD19-细胞群中均介导基因组编辑，而CD19-scFv Cas9-EDV只在CD19+细胞中诱导基因敲除(图1c)。并且抗体靶向的Cas9-EDV活性是可滴定的，高达74%的靶细胞表现出基因敲除，而在旁观者、非靶细胞中几乎检测不到基因编辑(图1d、e)。这些结果证明EDV能够以受体介导的方式递送功能性分子并且需要抗体与抗原的相互作用。
图1. 利用抗体靶向Cas9-EDV进行细胞特异性基因组编辑
随后为了在体内用药前提高Cas9-EDV的产量和每粒子的编辑效率，作者筛选了Cas9的多个N端核定位信号（NLS），发现2×p53衍生的NLS和3×核输出序列（NES）附加到Gag 8的C端最能提高抗体靶向Cas9-EDV的编辑效率，通过Gag-NES-NLS-Cas9和Gag-pol质粒骨架表达sgRNA可进一步提高编辑效率(图2a,b)。在对细胞因子刺激的原代人CD34+细胞和细胞因子刺激并激活的原代人T细胞进行离体测试时，经广谱转导的假型VSVG糖蛋白优化的Cas9-EDV也显示出更强的基因组编辑活性(图2c、d)。但特别的是，优化的假型VSVG Cas9-EDV在静息的原代人类T细胞中介导了基因组编辑(图2e)。表明在没有细胞激活、刺激和扩增的情况下，Cas9-EDV可能是基因组编辑T细胞的有效策略。
然后为了探究了Cas9-EDV内部蛋白水解介导的病毒成熟过程中形成的慢病毒衣壳是否会影响编辑效率(图2f)，作者使用GS-CA1，这是一种抑制核输入和/或随后揭开HIV-1衣壳核心的小分子抑制剂(图2g)。用浓度梯度的GS-CA1处理靶细胞会阻止慢病毒转基因的整合，这种整合依赖于衣壳的核输入(图2h)，但结果表明其对Cas9- EDV(图2i)的基因组编辑效率没有负面影响。
图2. 优化Cas9-EDV以增强原代人类细胞的基因组编辑活性
随后作者发现，以CD25表达为标记物，CD3和CD28靶向分子共同表达在Cas9-EDV上会引发T细胞激活和细胞扩增，这与使用市售CD3或CD28包被磁珠或工程化慢病毒转导的T细胞类似(图3a,b)。CD3+CD28 scFv Cas9-EDV处理也会产生强力的基因组编辑水平(图3c)。与单独显示CD3或CD4 scFv靶向分子的Cas9-EDV相比，在同一Cas9-EDV上复用CD3和CD4 scFv靶向分子会导致更高的编辑水平(图3e)。
图3. 原代人类T细胞的多重抗体靶向和编辑
作者利用移植人类外周血单核细胞(PBMC)的免疫缺陷小鼠来模拟人源化免疫系统，测试了靶向T细胞的载体在体内生成CAR T细胞(LV)或基因编辑CAR T细胞(Cas9-EDV载体)的能力(图4a)。全身给药含有CAR转基因的T细胞靶向Cas9-EDV或含有CAR转基因的T细胞靶向慢病毒(图4b)。通过流式细胞术检测发现，在所有成功移植人类细胞的小鼠中都观察到了CAR转导的T细胞(图4c、d)，并且均能观察到T细胞和CAR T细胞的等位基因修饰(图4e、f)。结果表明，基于抗体的Cas9-EDV靶向是一种能在体内维持细胞选择性和组织特异性的传递转基因和基因组编辑策略。
最后，作者评估了体内CAR T细胞的杀伤活性。在Cas9-EDV处理的小鼠中观察到了CD19+B细胞，而在抗体靶向慢病毒处理的小鼠中没有，这证明了体内CAR T细胞介导的细胞毒性(图5a)。从两组小鼠体内分离的转导CAR T细胞中观察到了不同的T细胞克隆型(图5c)，这表明多个细胞在体内被工程化，而不仅仅是通过单个工程化细胞的扩增。
图5. 体内细胞工程化的功能动态。
综上所述，本文通过展示细胞选择性靶向分子来重新定向病毒或病毒载体的趋化性，实现了一种已有的传递策略。研究人员通过将单链抗体片段与病毒糖蛋白结合，包装CRISPR-Cas9蛋白和引导RNA，可将基因编辑工具传递到特定细胞。研究结果表明，抗体靶向的Cas9-EDV在混合细胞群体中优先对目标细胞进行基因编辑。通过使用多重靶向分子将Cas9-EDV导向人体T细胞，研究人员在人源化小鼠中成功生成了基因编辑的嵌合抗原受体T细胞，建立了一种可编程的传递模式，具有广泛的治疗效用潜力。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-023-02085-z
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