本篇文献主要研究了使用低配基密度阳离子交换 (CEX) 层析介质 Eshmuno® CP-FT，用于通过连续上样来去除单克隆抗体 (mAb) 进料中的聚集体。相对于结合/洗脱的上样过程，使用连续上样的 CEX 介质去除 mAb 聚集体是有利的，因为介质几乎可以使用其全部载量来结合聚集体，从而实现更高的上样量。
什么是前沿层析（Frontal Chromatography）？
前沿层析是指是在混合物的所有成分都与介质结合的条件下连续上样层析柱。根据混合物的组分与介质相互作用的相对强度将其分离成前沿峰。最弱相互作用的组分将首先以纯净形式从层析柱中洗脱。从层析柱中洗脱的下一个前沿将由最弱的相互作用组分加上次强的相互作用组分组成。连续的前沿将作为混合物离开层析柱，其中包括先前洗脱的前沿的所有组分。该过程持续进行，直到层析柱达到其对相互作用最强的组分的最大载量。
前沿层析通常不用于蛋白质的制备规模纯化，但是 Hill 等人证明它可以用于混合物中最弱相互作用组分的制备纯化。用 CEX 介质去除 mAb 聚集体是前沿层析制备规模应用的一个机会，因为相对于聚集体，mAb 单体与 CEX 介质的相互作用较弱。因此，单体将首先作为单一组分从 CEX 层析柱中洗脱，并且层析柱可以继续上样 mAb 进料，直到其完全被聚集体占据。实际上，在聚集体开始洗脱后，一些单体可能仍被层析柱保留。然而，通过该方法仍然可以实现良好的单体回收率，因为在较高载量下，保留的单体量仅占处理的单体总量的一小部分。
首先，研究了使用连续上样过程的Eshmuno® CPFT 介质去除聚集体的情况，以确定 mAb 单体与聚集体的分离是否符合前沿层析机制。
将含有 10% 聚集体的 mAb05 进料透析到 pH 5.0 和 5 mS/cm 的 100 mM 乙酸钠缓冲液中，然后上样到 Eshmuno® CP-FT 介质层析柱上。通过尺寸排阻色谱分析从层析柱中洗脱的级分的组成：最初，仅观察到单体从层析柱中洗脱。载量为 600 g/L 时，洗脱液中也检测到二聚体。当载量达到 1000 g/L 时，没有观察到更高分子量的聚集体。这说明1000 g/L的上样载量也没有使得聚集体达到满载。
截留在层析柱上的组分进行SEC分析显示，在200g/L的载量下，被层析柱保留的mAb05进料的组成由71%单体组成，而在1000g/L的载量下，被层析柱保留的单体百分比下降至9% 。被层析柱保留的聚集体的组成包括二聚体和较高分子量的聚集体。这些结果与前沿层析机制一致，其中 mAb 单体最初被层析柱保留，随后被聚集体取代。
选择了市售的六种阳离子层析介质都进行连续上样，分析对聚集体的去除情况。选择的溶液 pH 值为 5.0，电导率为 5 mS/cm，因为在这些溶液条件下， CEX 介质通常对 mAb单体和聚集体具有较高的载量。将含有11%聚集体的mAb05进料在pH5.0和5mS/cm下透析到100mM乙酸钠中，上样到CEX层析柱上，并测定洗脱组分的组成。
结果显示，Eshmuno® CPFT介质是这五种介质中最不同的，因为它去除了更多的聚集体，并具有更好的单体回收率。 Eshmuno® CP-FT 介质的洗脱收集中含有 0.8% 的聚集体，载量为 741 g/L 时单体回收率为 92%。相比之下，其他 CEX 层析介质的洗脱收集在单体回收率达到 50% 之前均超过 1% 聚集体。
测量了介质离子密度和mAb05的静态结合能力，以确定这些属性中的任何一个是否与连续上样过程有效去除聚集体相关。
绘制了载量约为 1000 g/L 时洗脱收集中聚集体的累积百分比作为两个变量的函数的图。
结果显示，离子密度和洗脱收集中聚集体的百分比之间存在粗略的相关性。没有发现 CEX 介质的 mAb05 静态结合能力与其洗脱收集中聚集体的百分比之间存在相关性。
使用 mAb05 进料和 mAb02 进料研究了溶液 pH 值对使用连续上样过程的 Eshmuno® CP-FT 介质去除聚集体的影响。将含有10%聚集体的mAb05进料和含有6%聚集体的mAb02进料透析到pH变化的乙酸盐缓冲液中。
结果显示，对于 mAb05 和 mAb02 进料，随着溶液 pH 值降低，更多的聚集体被去除，单体回收率更高。
使用 mAb05 进料和 mAb02 进料研究了溶液电导率对使用连续上样过程的 Eshmuno® CP-FT 介质去除聚集体的影响。将含有10%聚集体的mAbO5进料和含有6%聚集体的mAbO2进料透析到电导率不同的乙酸盐缓冲液中。
结果显示，随着溶液电导率降低，从mAb05 进料和 mAb02 进料中去除了更多聚集体，单体回收率更高。
使用含有 11% 聚集体的 mAb05 进料，研究了保留时间对采用连续上样工艺的 Eshmuno® CP-FT 介质去除聚集体的影响。
结果显示，随着保留时间的增加，更多的聚集体从 mAb05 进料中去除，单体回收率更高。
使用含有 10% 聚集体的 mAb05 进料，研究了使用连续上样工艺，mAb 进料浓度对 Eshmuno® CP-FT 树脂去除聚集体的影响。
结果显示，随着 mAb05 进料浓度的降低，更多的聚集体被去除，具有更高的单体回收率。
为了检查 mAb 进料中的聚集体百分比对使用连续上样过程的 Eshmuno® CP-FT 介质去除聚集体的影响，制备了六种 mAb05 进料，其聚集体百分比范围为 1.9% 至 14.6%。
结果显示，对于所有六种 mAb05 进料，可以选择特定的进料载量，使洗脱收集中的聚集体水平降至 1% 以下，单体回收率大于 85%。还观察到，随着 mAb05 进料中聚集体百分比的增加，聚集体在较低的载量下从层析柱中洗脱。
另外，随着 mAb05 进料中聚集体百分比的增加，去除聚集体的有效载量范围变得更窄。
本片文献研究了低配体密度阳离子交换(CEX) 层析介质 Eshmuno® CP-FT的连续上样工艺以去除单克隆抗体 (mAb) 进料中的聚集体。研究发现，采用连续上样工艺使用 Eshmuno® CP-FT 去除 mAb 聚集体的机制与前沿层析机制一致，其中mAb 单体最初与层析柱结合，随后被二聚体和更高分子量的聚集体取代。使用连续上样过程的 Eshmuno® CP-FT 去除 mAb 聚集体与其他六种市售强 CEX 层析介质进行比较，发现与其离子密度相关，但与 mAb 静态结合能力无关。还研究了 pH、电导率、停留时间和 mAb 浓度对使用连续上样过程的 Eshmuno® CP-FT去除聚集体的影响。最后，改变 mAb 进料中聚集体的百分比，以检查使用连续上样过程的 Eshmuno® CP-FT去除聚集体的效果。
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