文献分享|Nature communications|在SCNT介导下，杜鹃素直接激活UCHL3促进DNA修复和重编程
这篇文献是2023年发表在Nature Communications上的文章，题目为“Farrerol directly activates the deubiqutinase UCHL3 to promote DNA repair and reprogramming when mediated by somatic cell nuclear transfer”。
天然黄烷酮杜鹃素通过促进同源重组（HR）修复来提高基因组编辑效率，但杜鹃素直接靶向调控HR修复的具体蛋白以及潜在的分子机制尚未确定。在这里发现去泛素化酶UCHL3是杜鹃素的直接靶标。机制上，杜鹃素通过增强UCHL3的去泛素化酶活性促进RAD51去泛素化，从而改善HR修复。重要的是，发现体细胞核移植（SCNT）胚胎表现出HR修复缺陷。基因组不稳定性和非整倍体增加，并且核移植后杜鹃素处理增强HR修复，恢复转录和表观遗传网络，并促进SCNT胚胎发育。敲除UCHL3显著减弱杜鹃素对HR和SCNT胚胎发育的刺激作用。综上，鉴定了杜鹃素作为去泛素化酶UCHL3的激活剂，强调了HR和表观遗传变化在SCNT重编程中的重要性，并提供了一种促进SCNT效率的可行方法。
01
背景
高效的DNA修复可以保存细胞内的遗传信息；因此，DNA修复在各种生物过程中起着基础和关键的作用，如早期胚胎发育、衰老、肿瘤发生和细胞重编程。在这些需要细胞分裂的过程中，同源重组（HR）修复途径尤为重要，因为该途径负责修复S/G2期的DNA双链断裂（DSBs）；此外，HR途径的缺陷可能导致胚胎致死、早衰、肿瘤发生和细胞重编程缺陷。因此，假设为针对直接调控HR途径的修复因子的帽子可能是提高基因组稳定性和优化这些过程的一个很好的途径。
体细胞核移植（SCNT）是一种可能帮助体细胞重获全能性的技术，重编程的全能性细胞可以进一步产生有活力的个体。由于SCNT产生囊胚和存活后代的效率仍然很低，因此人们一直在努力寻找提高SCNT效率的关键分子因素。然而，这些干预措施在很大程度上未能促进SCNT胚胎的植入后发育速度，这表明除了表观遗传操作外，SCNT胚胎在植入后发育过程中还存在其他未知的缺陷。为了完成scnt介导的重编程，供体细胞核基因组必须在1-2个细胞周期内从体细胞状态快速过渡到早期胚胎状态，以实现合子基因组激活（ZGA）和进一步发育。该过程涉及以下主要转变：一是供体细胞染色质中固有的体样3D基因组结构迅速解体，二是供体细胞核从有丝分裂中期样状态过渡到减数分裂中期样状。相比之下，具有类似转化过程的原始生殖细胞的形成在小鼠体内通常需要数周时间。因此，在SCNT重编程过程中，供体细胞的核基因组承受着巨大的压力，极易受到DNA损伤。开发新的激活DNA修复的方法来对抗SCNT过程中累积的DNA损伤，可能会提高SCNT胚胎的发育潜能。
HR修复缺陷会破坏基因组的稳定性，导致胚胎发育受损。例如，敲除限制性HR因子重组酶RAD51会导致着床前致死，而破坏两个关键HR因子RAD50和BRCA1会减少细胞增殖并导致着床前胚胎发育异常。许多E3连接酶和去泛素酶通过改变关键的HR因子参与HR修复的调节。去泛素化酶UCHL3是泛素羧基末端水解酶（UCHL）家族的成员，在小鼠受精和着床前发育中起重要作用。在应对DNA损伤时，UCHL3被ATM磷酸化并激活，活化的UCHL3通过去泛素化RAD51促进BRCA2-RAD51相互作用正向调控HR。此外，UCHL3去泛素化并稳定TDP1以促进TOP1诱导的单链断裂的修复。
02
研究结果
1 去泛素化酶UCHL3作为杜鹃素潜在作用靶点
前期工作中通过对大量小分子的筛选，发现杜鹃素在不影响NHEJ的情况下促进了HR修复途径，并且初步的机制研究表明杜鹃素促进了RAD51在DNA损伤位点的募集。然后为了进一步解析杜鹃素对HR修复的调控机制，所以试图确定杜鹃素直接靶向的特定蛋白。然后发现了101个可能与杜鹃素相关的不同肽段，进一步在对照组和杜鹃素处理组之间进行比较，发现有10个蛋白发现显著变化，表明这些蛋白可能是杜鹃素的潜在作用靶点。然后对10个蛋白中，PRKDC和UCHL3参与调控DNA修复。然后就对蛋白在293t细胞进行CETSA、热熔曲线验证。然后用不同浓度的重组UCHL3和杜鹃素进行SPR实验。（Tm是50%的蛋白质在热作用下解折叠并迅速沉淀的温度）。确定了UCHL3是杜鹃素的作用靶点。
2 通过lys187和Arg215两个氨基酸残基与UCHL3结合
为了探究杜鹃素如何与UCHL3特异性结合，在杜鹃素存在的情况下进行共晶。发现杜鹃素的酚羟基与UCHL3中的两个氨基酸ly187和arg215形成氢键。使用US-Align将UCHL3与泛素1XD3复合物的预沉积结构与共晶结构进行比对，两个结构归一化的得分为0.97，说明杜鹃素对UCHL3的动态结构没有影响。然后通过CETSA来确定两个氨基酸残基是否为UCHL3和杜鹃素之间相互作用必需的，创建了两个突变体，然后293T细胞表达。发现热稳定性没有提高，说明杜鹃素通过这两个氨基酸直接与UCHL3结合。然后用纯化重组的突变蛋白与杜鹃素进一步SPR验证，也证明了突变两个氨基酸位点消除了杜鹃素与UCHL3的结合。
3 杜鹃素激活UCHL3的酶活性促进HR修复
因为已经知道杜鹃素和UCHL3都是通过促进RAD51募集到DNA损伤位点，然后来参与HR的调节。又在前面证明了杜鹃素与UCHL3高度结合，所以想继续知道杜鹃素是否以UCHL3依赖的方式刺激HR。进行HR报告细胞系过表达UCHL3促进HR，确定UCHL3对于HR的作用。然后进行用有or没有杜鹃素处理的情况下，对比UCHL3缺失的HCA2-H15c细胞中HR效率，敲低后UCHL3消除杜鹃素对HR的刺激作用。然后在小鼠胚胎肝细胞（mESCs）也说明了杜鹃素介导的HR修复增强依赖于UCHL3，并通过分析HR效率的染色体外实验确定。
还通过焦点计数，还检测了敲除UCHL3的细胞2Gy剂量的电离辐射（IR）处理后，RAD51在DNA损伤位点的募集和yH2AX焦点的清除。在最找HCA2-HTERT细胞中，杜鹃素促进RAD51在DNA损伤位点的募集。可以看到杜鹃素处理后的细胞清除RAD51焦点的速度更快，在IR后4h加速了yH2AX的清除。但是在UCHL3缺失的HCA2-hTERT细胞中，DNA损伤部位的RAD51募集受损，杜鹃素也不能在IR损伤后4小时刺激募集。16h后，RAD51还在DNA损伤位点，杜鹃素无法清除RAD51病。在4Gy剂量的X射线照射细胞中，杜鹃素以依赖于UCHL3的方式促进RAD51的募集，并加速y-H2AX的清。然后进一步免疫荧光染色显示，杜鹃素在UCHL3-ko细胞中刺激了RAD51的募集，而在UCHL3-r215a/k187a突变体表达的IR处理的UCHL3-ko细胞中没有刺激RAD51的募集。说明杜鹃素依赖UCHL3促进HR的DNA修复。
因为已经说明了杜鹃素与UCHL3结合，然后想进行泛素-AMC测定来确定杜鹃素是否激活UCHL3酶活性，发现对Km和Kcat都有影响，说明杜鹃素激活了UCHL3去泛素酶活性。还进行了ub-CHOP2实验来检测杜鹃素是否直接调节UCHL3的酶活性。数据表明，浓度为0.1um的杜鹃素提高UCHL3的去泛素化酶活。说明杜鹃素是UCHL3的激活剂。已经报道了UCHL3使RAD51去泛素化促进与BRCA2的相互作用，从而模拟其在DNA损伤位点的招募并增强HR修复，所以作者研究杜鹃素是否以UCHL3依赖的方式促进RAD51的去泛素化。体外去泛素化实验显示，杜鹃素以剂量依赖的方式促进UCHL3介导的RAD51的去泛素化。杜鹃素处理增强了对照细胞中RAD51的去泛素化，敲除UCHL3消除了杜鹃素介导的RAD51去泛素化刺激，表明杜鹃素通过靶向UCHL3促进RAD51去泛素化。还进行了co-ip实验，杜鹃素处理后的293t中RAD51与UCHL3相互作用的变化，排除了杜鹃素通过增强UCHL3-RAD51相互作用促进RAD51去泛素化的可能性。表明杜鹃素通过激活UCHL3的去泛素化酶活性来促进RAD51的去泛素化从而增强HR修复。
4 杜鹃素有助于SCNT胚胎克服遗传障碍
以往的研究表明，除了已知的表观遗传障碍，诸如DNA损伤、高频率的DSBs和染色体完整性受损等遗传异常也构成了极大地阻碍细胞转变的障碍。另外，这些遗传障碍不仅可能导致早期胚胎发育停滞，还可能严重抑制其植入后的发育潜能。想了解杜鹃素介导的HR增强是否在这个过程中发挥作用。
观察到四细胞器SCNT胚胎卵裂球中染色体拷贝数异常比例高于IVF胚胎。还检测了基因组不稳定性也增加了，用碱性彗星实验，用抗y-H2AX抗体免疫染色实验检测SCNT胚胎两细胞周期DSBs的积累。在桑葚胚SCNT胚胎和SCNT来源的胚胎肝细胞（SCNT-mESCs）中经常观察到非整倍体核型。在SCNT胚胎发育后期，伴随着非整倍体的出现，每个胚胎的y-H2AX焦点数量显著增加。这些结果表明基因不稳定性在核移植胚胎的早期阶段就出现了，并且在整个重编程过程中保持在较高的水平。
所以作者推测HR介导的修复下调可能是导致SCNT胚胎基因组不稳定性增加的原因。发现SCNT组ESC系的HR效率显著低于IVF。同时在二细胞期SCNT组细胞核中RAD51焦点数量较IVF组显著减少。MRE11的抑制剂mirin（~16h）瞬时处理HR修复基因的启动，明显阻断了SCNT介导的重编程，延迟了早期胚胎发育。这种有效的HR是早期胚胎发育所必需的，但在SCNT胚胎中效率很低。
考虑到杜鹃素能显著提高HR修复的效率，以及HR通路主要依赖于存在于S期和G2期的姐妹染色单体作为修复模板，当这些被操纵的SCNT胚胎在sr2+激活后开始进入第一个细胞周期的阶段时，杜鹃素也能进入。短期的杜鹃素处理（~16h）显著增强SCNT胚胎和SCNT衍生的ESCs基因组稳定性、HR效率、细胞核内RAD51焦点数量和整倍体维。并且，杜鹃素处理显著提高了SCNT胚胎的着床前发育潜能，约2。浓度依赖进行精确测试后，确定0.05um为最佳浓度。几乎90%的2-细胞胚胎可以正常发育到4-细胞阶段，极大地改善了2-细胞阻滞，这是体细胞重编程过程中转换障碍。
HR修复在SCNT胚胎中时低效的，而杜鹃素作为HR的有效调节剂，可以促进SCNT胚胎克服遗传屏障，维持基因组稳定性，从而提高重编程效率。
5 杜鹃素改善了SCNT胚胎中转录和表观遗传重编程不足的问题
为了揭示杜鹃素激活HR修复如何影响转录网络，收集了有或没有杜鹃素处理的SCNT胚胎进行RNA-seq分析，野生型IVF胚胎作为对。在杜鹃素处理后，SCNT中失调的重编程抗性区域（RRRs）得到了部分恢复。观察到典型的合子基因组激活（ZGA）相关基因如Dux和Zscan4基因簇的上调。在ZGA阶段的恢复可能会进一步增强此后有效的转录重编程，并促进后期的胚胎发育，这在一定程度上解释了杜鹃素处理提高囊胚率的原因。在比较桑葚胚期各组的转录组时，观察到杜鹃素处理使SCNT胚胎中的总基因表达模式改变为与IVF组相似的模式。胚胎发育和进一步分化的重要基因上调（cluster I），而在杜鹃素处理组中，异常的体细胞特征（如id1、DNA结合抑制因子1和sox4、sSRY-box转录因子）被大量删除（cluster II）。
具体来说,胚胎极性这一有助于谱系分化正常进行的特征,在杜鹃素处理组中得到了显著改善,表现为极化相关基因的高表达,如klf5和arpc。分别是内细胞团(ICM)和滋养外胚层(TE)谱系的重要标志基因Nanog和Cdx2在杜鹃素处理组中的表达量远高于未处理。另外,在杜鹃素处理的SCNT囊胚中观察到更多的ICM数量和恢复的TE/ICM比值,表明添加杜鹃素，SCNT胚胎中的第一谱系分化潜能更加优越。与谱系基因的恢复一致,杜鹃素处理组中NANOG和CDX2的靶基因表达也得到了有效的提高。这些数据表明,早期的杜鹃素处理可以提高SCNT胚胎后期发育轨迹的准确性。
除了多能性转录组的恢复,发现杜鹃素处理能够进一步促进SCNT过程中的表观遗传重编程.在用杜鹃素处理的IVF和SCNT胚胎中观察到组蛋白变异体H3.3的更高富集,表明高效的HR修复可能有助于染色质重塑,RRRs中的修复也证实了.然而,这种染色质打开并没有引起显著的全局5-mC变化。与谱系规范过程中基因表达调控密切相关的抑制性组蛋白修饰H3k27me3在杜鹃素处理的SCNT胚胎的ICM显著富集。高水平的H3k27me3在防止二价基因的过早激活中起着关键作用,这进一步保证了移植后胚胎进行谱系分化.杜鹃素处理的SCNT胚胎进一步成功分化为Gata6阳性的原始内胚层(PrE)细胞,而在未处理的SCNT组中,这一比例显著降低。除了Nanog,cdx2和Gata6,还观察到其他谱系分化相关基因的表达,包括Klf4,esrrb,gata3和pou5f1,在杜鹃素处理组中提高。
杜鹃素改善了SCNT胚胎受损的转录和表观遗传重编程,并有助于适当的谱系特化
6 杜鹃素提高SCNT效率,很大程度上依赖于UCHL3
为了进一步测试杜鹃素对SCNT胚胎移植后能力的影响,移植了杜鹃素处理后的SCNT胚胎在2细胞进入假孕受体雌鼠，虽然转移的未经处理的SCNT2-细胞中仅有0.2%发育为足月E19.5仔鼠，但该比例在杜鹃素处理后显著增加。杜鹃素处理的SCNT胚胎所获得的新生仔鼠的平均体重与IVF来源的仔鼠无差别，并且仔鼠可以健康成熟为可育的成年鼠，杜鹃素处理有效地恢复了SCNT胎盘的持续性增生。杜鹃素部分降低了SCNT胚胎产生的胎盘重。经过杜鹃素处理的SCNT胚胎胎盘的结构更有组织,显示出三层光滑的边缘,这提供了结构的完整性。在杜鹃素处理组的胚胎外胚层中,可以检测到非典型(如Slc38a4和Sfmbt2)和典型(H19和Igf2)印迹基因的表达恢复。杜鹃素可以部分改善SCNT胚胎中常见的胎盘增生,这种改善表现为重量减轻\结构紧凑和有效压缩海绵滋养层,其中典型和非典型印记的获救表达可能是显著的。
为了验证杜鹃素是否通过靶向UCHL3提高SCNT效率，在核移植之前之前，通过去核卵母细胞注射针对UCHL3基因的sgRNA和siRNA来敲除UCHL3.结果显示，UCHL3敲低显著抑制了杜鹃素诱导的SCNT胚胎发育率的增加，但对IVF胚胎的发育没有影响。具体来说，UCHL3敲低后的死细胞和囊胚发育率分别只有70%和52.78%。作为对比，在野生型杜鹃是处理的SCNT胚胎中，这一比例高达90.08%和69.44%，这表明UCHL3是杜鹃素中重要靶标，并导致了SCNT效率的提高。此外，杜鹃素处理降低了DSBs的数量，如对照SCNT胚胎两细胞期的y-H2AX焦点，UCHL3敲除取消了杜鹃素介导的DSBs数量的抑。此外，UCHL3缺失的SCNT囊胚在杜鹃素处理后没有表现出ICM和原始内胚层（PrE）细胞数量的增加或Gata6表达的恢复。在杜鹃素处理的SCNT囊胚中，H3K27甲基化的富集也收到了损害，H3K27甲基化阳性ICM的百分比从43.75下降到20%。为了检测UCHL3敲低是否进一步影响杜鹃素处理的SCNT胚胎的附植后发育潜能，将这些胚胎移植到假孕小鼠中。发现UCHL3的缺失完全削弱了杜鹃素对产生克隆小鼠的积极作用，没有UCHL3缺失的杜鹃素处理的2-细胞SCNT胚胎可以正常发育到E19.5期。
这些结果证实了杜鹃素改善SCNT胚胎的发育在很大程度上依赖于UCHL3，UCHL3是杜鹃素作用的靶蛋白。
03
讨论
本研究采用lip-ms与实验验证相结合的方法，探讨了杜鹃素的直接靶点，以及靶点在SCNT中的作用机制。Lip-ms提供了几个潜在靶点，然后作者进行筛选，再进行动物和细胞实验进行验证，为我们寻找药物靶点的研究提供了思路。我们也是通过lip-ms寻找中药单体靶点，再后续的筛选靶点以及验证实验方法，都可以借鉴文中的方法。
