在脱髓鞘疾病诸如多发性硬化症（MS）中，少突胶质前体细胞（OPCs）分化为髓鞘生成少突胶质细胞（OLs）是髓鞘修复过程中的关键步骤。然而，慢性脱髓鞘疾病常伴随髓鞘修复失败，这部分归因于胶质细胞分泌的因子在OPSc分化过程中产生矛盾作用，从而持续阻碍髓鞘重建，并导致临床症状的恶化。星形胶质细胞作为中枢神经系统中的主要细胞类型，在响应病理刺激时发生反应性变化，影响OLs的存活和髓鞘修复。既往研究表明，Clusterin（CLU，簇集蛋白）在多发性硬化症患者中显著增加，尤其在活动性病灶中的星形胶质细胞亚群中表达升高。CLU的异常调控抑制了髓鞘碎片的清除并阻碍OPCs分化，成为髓鞘修复失败的潜在病理因素。
团队和文章信息
2024年9月6日，中山大学附属第三医院神经内科邱伟教授团队在《Nature Communications》（IF:14.7）发表了题为Astrocyte-derived clusterin disrupts glial physiology to obstruct remyelination in mouse models of demyelinating diseases的论文。本文发现并证实CLU是一种可诱导的星形胶质细胞来源的因子，通过发挥自分泌和旁分泌的有害作用，破坏星形胶质细胞清除髓鞘碎片的功能，并促进OLs死亡。敲低或敲除星形胶质细胞中的CLU，能够改善动物模型中的脱髓鞘病理表现。
研究者通过单细胞RNA测序分析多发性硬化症（MS）患者的细胞图谱，分析数据揭示了四种星形胶质细胞亚型（Ast1-4）在不同病理区域的比例。同时，使用EAE模型(实验性自发性脑脊髓炎)和LPC（溶血卵磷脂）诱导的脱髓鞘模型，检测CLU在脱髓鞘病变中的表达模式。测序数据分析显示CLU主要来源于星形胶质细胞，特别是Ast2亚型在活动性病变中表现出高表达，然而，在铜酮诱导的脱髓鞘模型中未观察到CLU的上调，显示CLU表达的特异性变化与疾病类型相关。
接下来为了探讨CLU的旁分泌效应，并研究其对OPCs的影响，研究人员用CLU处理从原代神经前体细胞（NPCs）分化的OPCs，进一步采用Bulk RNA测序分析CLU对OPCs的作用。分析结果表明CLU的短期处理（3小时）未显著改变基因表达，但其表现出对OPCs的毒性效应，影响其生物过程，如细胞死亡途径。经过24小时处理后出现615个基因上调，189个基因下调，下调基因与少突胶质细胞分化和髓鞘形成相关，提示CLU可能通过诱导DNA损伤抑制OPCs的增殖并促进其凋亡以及PI3K-AKT信号通路在CLU介导的破坏性效应中可能起重要作用。
为了进一步探讨CLU对OPCs及OLs分化和生存的影响，研究人员结合体外、内实验，使用不同浓度的CLU处理OPCs，评估其对MBP+细胞数量、增殖标志物EdU和凋亡标记物cleaved caspase-3（CC3）的影响。结果表明CLU以剂量依赖性和时间依赖性抑制OPCs的分化和增殖，促进其细胞凋亡，并且减少MBP+细胞（标志OPCs）和OLs数量，并显著降低新生髓鞘区域。随后，研究者采用NG2-CreER2小鼠模型研究体内CLU对OLs和髓鞘的影响，结果显示CLU处理导致髓鞘厚度下降，但不影响轴突直径，强调了CLU对OPCs、OLs和髓鞘的损害作用。
研究人员进一步利用Cre-DIO系统在星形胶质细胞中高表达CLU，以研究其对少突胶质前体细胞（OPCs）和少突胶质细胞（OLs）的影响。他们将rAAV-GfaABC1D-CreEGFP与rAAV-CMV-Dio-CLU-mCherry或rAAV-CMV-Dio-mCherry共同注射至小鼠胼胝体中，三周后评估CLU表达和相关细胞变化，结果显示CLU在星形胶质细胞中的过表达导致NG2+ OPCs和CC1+ OLs显著减少，且CC3+ OPCs和OLs比例增加，提示CLU促进了这些细胞的凋亡。同时，髓鞘厚度降低，而轴突直径未受影响，表明CLU对髓鞘形成产生负面影响。
接下来，通过一系列实验检测到OPCs中的CLU受体ApoER2和VLDLR的表达，同时使用携带VLDLR shRNA的慢病毒在OPCs中特异性表达以评估CLU诱导的损伤。结果表明CLU的上调可能驱动了CLU信号通路的活跃，OPCs中VLDLR特异性敲除显著缓解了CLU诱导的OPC损伤，表明VLDLR可能是CLU介导的OPC损伤的表面受体。
为了探究CLU如何影响PI3K-AKT信号通路，研究人员通过转录组分析和WB实验，评估CLU刺激后PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平，同时使用AKT激动剂SC79和拮抗剂MK2206干预CLU诱导的损伤过程。结果表明CLU刺激导致PI3K-AKT信号通路的抑制，SC79显著减少了NG2+ OPCs和CC1+ OLs的损失，显示出保护作用；而MK2206则加重了CLU诱导的损伤，表明CLU通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路促进OPCs和OLs的凋亡。
接下来他们构建携带CLU特异性shRNA的AAV（AAV-shCLUEGFP）并通过立体定位注射至小鼠胼胝体，随后注射LPC诱导炎症性脱髓鞘病变。随后在不同时间点（5天、10天和21天）收集组织样本并分析OPCs谱系和髓鞘的变化。分析结果显示，与对照组相比，AAV-shCLU-EGFP显著增加了炎症性脱髓鞘病变中NG2+ OPCs的数量，促进了OPC的增殖和分化。CLU敲除后，髓鞘厚度增加且未影响轴突直径，表明CLU抑制能增强胼胝体的再髓鞘化过程。
最后为了验证CLU基因条件性敲除对OPCs和髓鞘再生的影响，特别是在星形胶质细胞中的作用，研究者构建ALDH1L1-CreERT::CLUfl/fl小鼠，通过注射LPC诱导脱髓鞘病变，并在条件性敲除CLU后观察OPCs和OLs的变化。结果表明在CLU条件性敲除小鼠中，Olig2+ OPCs和CC1+ OLs数量显著增加，髓鞘变厚，而轴突直径无显著变化。CLU的缺失在EAE模型中也表现出保护作用，延迟了疾病的发作，并减少了临床严重性，表明星形胶质细胞中的CLU缺失有助于促进OPCs分化和再髓鞘化。
CLU在脱髓鞘疾病中的作用
本研究揭示了CLU蛋白在MS和其他脱髓鞘疾病中的病理作用，表现在抑制星形胶质细胞对髓鞘碎片的清除以及干扰OPCs的再髓鞘化过程。通过敲低或敲除星形胶质细胞中的CLU，能够改善动物模型中的脱髓鞘病理表现，证明CLU是MS的潜在治疗靶点。
研究局限性
由于CLU在实验中持续活跃，导致OPCs和OLs的持续死亡，因此难以精确量化其对脱髓鞘和再髓鞘化的影响。此外，不同的实验模型表现出对CLU的不同反应，表明在不同脱髓鞘环境下可能存在不同的机制，因此需要更进一步的研究去探索CLU在不同疾病下的具体作用。
TO US
未来的研究应进一步探讨CLU对不同胶质细胞类型的影响，特别是在不同的脱髓鞘模型中的差异反应。这有助于更好地理解CLU的作用机制，推动针对CLU的精准治疗策略的开发。
Q & A
Q1：CLU是如何通过抑制PI3K-AKT信号通路影响OPC分化和髓鞘再生的？
A：CLU通过与低密度脂蛋白受体（VLDLR）结合，阻断了少突胶质前体细胞（OPC）的PI3K-AKT信号通路。这一信号通路对于细胞的存活、分化和生长至关重要。当PI3K-AKT通路被CLU抑制时，OPC无法顺利分化为成熟的少突胶质细胞（OLs），从而阻碍了髓鞘再生。此外，CLU的持续作用还会导致OPC凋亡，进一步损害中枢神经系统中的髓鞘修复过程。通过激活AKT（例如使用SC79），可以部分逆转CLU的有害影响，促进OPC存活并恢复髓鞘再生。
Q2：CLU的过量表达如何抑制星形胶质细胞清除髓鞘碎片？
A：部分原因是CLU下调了与碎片清除相关的关键蛋白，如脂质运载蛋白2（LCN2）。LCN2在髓鞘碎片结合和吞噬过程中起重要作用，CLU通过减少LCN2的表达，削弱了星形胶质细胞的碎片清除能力，导致髓鞘碎片积累，进一步阻碍了少突胶质前体细胞的分化和髓鞘再生。此外，CLU可能与星形胶质细胞的其他受体或信号通路产生竞争性干扰，从而减弱其碎片吞噬功能。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-52142-7
编辑：安纪蓉
排版：bonbon
校对：杨诗歌
审核：曹秋晨
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