O-乙酰葡糖胺糖基化修饰 (O-GlcNAcylation) 是一种翻译后修饰，通过将O-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）添加到蛋白质丝氨酸和苏氨酸残基上来调节蛋白质功能。其水平受葡萄糖代谢和细胞能量状态的影响，是细胞营养感应和代谢调节的关键机制。β-N-乙酰葡萄糖胺糖基转移酶(OGT)和去糖基化的β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷水解酶(OGA)，这两种修饰酶以营养应答和应激反应的方式控制该蛋白质修饰的动态平衡。O-GlcNAc的稳态失调与多种慢性疾病，如心血管疾病、阿尔茨海默病和癌症相关。在糖尿病视网膜病变中，O-GlcNAc信号在内皮细胞中的具体作用尚不明确。
*注释：
O-GlcNAc：O-乙酰葡萄糖胺
O-GlcNAcylation：O-乙酰葡糖胺糖基化修饰
团队和文章信息
2024年10月29日，来自天津医科大学的颜华/王晓虹团队在《Nature Communications》（IF: 14.7）发表了题为Protein O-GlcNAcylation coupled to Hippo signaling drives vascular dysfunction in diabetic retinopathy的论文。本文揭示了内皮细胞O-GlcNAcylation在高血糖或缺氧条件下增强，这种修饰导致Hippo通路效应因子YAP/TAZ的异常活化，从而导致糖尿病视网膜病变血管功能障碍。
本研究通过ELISA检测分析了糖尿病视网膜病变（DR）患者和非糖尿病患者玻璃体液中UDP-GlcNAc的浓度，结果显示UDP-GlcNAc在DR患者中显著升高。此外，研究利用STZ诱导的糖尿病小鼠模型和氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型，通过Western blot和免疫荧光对O-GlcNAcylation蛋白进行检测，发现糖尿病和低氧条件下，视网膜内皮细胞中的O-GlcNAc水平显著高于对照组。结果表明，O-GlcNAcylation在糖尿病条件下显著增加，可能在DR病理过程中起关键作用。
接着，本研究探讨了O-GlcNAcylation对细胞增殖和血管生长的影响。使用PUGNAc（O-GlcNAc水解酶抑制剂）处理内皮细胞以提高O-GlcNAc水平，BrdU掺入实验结果显示细胞增殖显著增加；而利用体外芽生长实验观察到血管芽长度增加。敲低OGT则相反，抑制了增殖和血管芽生长。该实验结果表明，O-GlcNAcylation可显著增强内皮细胞的增殖和血管生长，提示其在促进血管异常中的作用。
通过PUGNAc处理人类视网膜内皮细胞（HRCECs）并进行RNA测序，研究发现PUGNAc显著激活了与Hippo-Yap信号通路相关的基因。在高糖条件下，YAP和TAZ的O-GlcNAcylation水平显著增加。质谱分析进一步表明，YAP的T383位点是关键的O-GlcNAcylation位点，该修饰抑制了YAP在S397位点的磷酸化，从而增加其稳定性和活性。以上结果表明，O-GlcNAcylation通过调控YAP的磷酸化与稳定性，增强了Hippo-Yap信号在高糖环境中的活性，可能促进了视网膜血管病变的进展。
该部分探讨O-GlcNAcylation对YAP蛋白活性的具体调控机制。研究利用Western blot检测PUGNAc处理对YAP在S397位点磷酸化的影响，发现其磷酸化水平显著降低，YAP的稳定性和活性增加。O-GlcNAcylation的YAP蛋白在转录活性上的增加，导致下游基因（如CTGF和CYR61）的上调。结果表明，O-GlcNAcylation通过影响YAP的磷酸化调控其活性，在血管功能失调中起作用。
为进一步验证O-GlcNAcylation在DR模型中的作用，研究使用近距离连接分析（PLA）检测YAP/TAZ和OGT的相互作用，结果显示糖尿病和低氧条件下YAP/TAZ的O-GlcNAcylation显著增强。人类和小鼠的DR模型显示YAP/TAZ活性增强，表现为其下游基因的表达增加。结论指出，O-GlcNAcylation的YAP/TAZ在内皮细胞中的异常活化可能推动了DR中的血管异常。
作者在STZ诱导的糖尿病小鼠中，利用4-OHT诱导特异性敲除YAP/TAZ，以观察这些蛋白在视网膜血管中的功能。研究发现，YAP/TAZ缺失组小鼠显示毛细血管壁细胞覆盖显著减少、无细胞毛细血管数量减少，以及血管异常的显著改善。在氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型中，通过异位Tamoxifen诱导敲除YAP/TAZ，并通过免疫染色评估视网膜血管的新生情况。结果显示YAP/TAZ敲除有效降低了视网膜新生血管面积和无血管区面积。
研究通过AAV-BR1注射方法，在OIR小鼠模型中引入YAP-T383A或YAP-WT，以观察YAP的突变如何影响血管新生。结果显示，与表达YAP-WT的组相比，表达YAP-T383A突变体的小鼠视网膜新生血管面积显著减少。在STZ小鼠模型中，作者通过4-OHT诱导特异性敲除YAP/TAZ，并用AAV-BR1携带的YAP突变体或EGFP对视网膜进行基因注入。CD31和Desmin染色显示，YAP突变体表达的小鼠视网膜中，毛细血管壁细胞覆盖显著增加，提示YAP-T383/S397轴可能影响血管屏障的完整性。
本实验探讨了外泌体递送YAP/TAZ抑制剂（EXOSuper-TDU）在改善糖尿病视网膜病变中的效果。作者通过将EXOSuper-TDU注射到STZ诱导的糖尿病小鼠中，评估其对血管功能的影响。结果显示，EXOSuper-TDU处理组小鼠的血管平滑肌细胞覆盖率显著提高，同时无细胞毛细血管数量减少，血管结构得以改善。在OIR模型中，EXOSuper-TDU也有效减少了视网膜新生血管的形成和血管渗漏，表明该治疗策略在DR中的潜在应用价值。
通过高糖处理的人类视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）实验，作者观察到O-GlcNAcylation水平显著上升，这与YAP/TAZ活性的增强密切相关。使用O-GlcNAc转移酶和水解酶抑制剂的实验结果进一步表明，O-GlcNAcylation的增加可促进YAP/TAZ的转录活性，从而影响内皮细胞的功能。以上结果强调了O-GlcNAc信号通路在糖尿病视网膜病变中的关键调控作用。
O-GlcNAcylation
本文主要分析了O-GlcNAcylation对糖尿病视网膜病变（DR）中血管功能失调的潜在作用机制及其临床意义。研究结果证实了高糖和低氧环境下的O-GlcNAcylation水平显著升高，并通过影响Hippo信号通路的关键效应因子YAP和TAZ而导致内皮细胞功能异常。研究发现，O-GlcNAcylation能够调控YAP的磷酸化状态，使其稳定性和转录活性增加，从而激活下游促血管生成和葡萄糖代谢的基因程序。这一机制揭示了O-GlcNAc-Hippo轴在DR发病过程中的重要作用。
Highlight
O-GlcNAcylation不仅影响血管内皮细胞的增殖和屏障功能，而且在一定程度上解释了糖尿病状态下血管异常的新机制。相比传统的抗血管生成治疗，如VEGF抑制剂，本研究提出了O-GlcNAcylation作为新的治疗靶点，具有潜在的应用优势。现有抗VEGF疗法虽然能缓解血管异常，但治疗效果短暂，且部分患者对其不敏感，而抑制O-GlcNAcylation则可能为那些抗VEGF无效的患者提供另一治疗选择。
研究局限性
尽管本文在小鼠模型中验证了O-GlcNAcylation对血管功能的影响，但在人类DR患者中的临床应用效果尚需进一步研究。此外，O-GlcNAcylation是否在其他糖尿病并发症中也具有类似作用也是值得探索的问题。作者建议未来研究应进一步评估O-GlcNAc调控机制的具体分子通路，并进行更大规模的临床研究，以验证O-GlcNAc-Hippo轴作为治疗DR的有效性。这些发现为改善DR的治疗方案提供了新的理论依据和潜在的靶向疗法方向。
Q & A
Q1：如何确定O-GlcNAcylation对YAP/TAZ活性的影响是通过直接修饰还是间接调控其他信号通路？
A：本文主要通过Western blot和免疫共沉淀等实验方法观察O-GlcNAcylation对YAP/TAZ的直接修饰。然而，为了明确其作用机制，可以通过使用特定抑制剂或小分子来阻断其他可能相关的信号通路（如mTOR或MAPK通路）进行进一步实验。这将有助于区分O-GlcNAcylation的直接作用与间接影响。此外，质谱分析可以用于精确定位YAP/TAZ的O-GlcNAcylation位点，确认其在功能上的重要性。
Q2：实验中使用的YAP/TAZ抑制剂EXOSuper-TDU在长期应用中的安全性和有效性如何评估？
A: 虽然本文显示EXOSuper-TDU在短期内有效改善了糖尿病视网膜病变的症状，但其长期安全性和有效性仍需通过临床前研究和后续的临床试验来评估。需要设计长期干预实验，观察小鼠在持续接受EXOSuper-TDU后的生理反应、体重变化以及可能的副作用。同时，评估不同剂量的EXOSuper-TDU对血糖水平和眼部组织的影响，以确保治疗策略的安全性。最后，临床试验的设计应包括不同患者群体，以评估个体化治疗的潜在效果和风险。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-53601-x#Sec2
编辑：吴欣阳
校对：倪铭蔚
排版：bonbon
审核：曹秋晨
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