纳米分子影像学在血栓诊断中的研究应用

近年来，血栓类疾病的致死率居高不下，严重威胁着人类健康。同时，血栓临床治疗的时效性显著影响患者的治愈率及预后生活质量。因此，精准诊断早期血栓至关重要。目前常用于血栓诊断的生物成像技术包括磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描成像(Computed Tomography，CT)、荧光成像、光声成像等。然而，当前的成像策略缺乏高灵敏度和强特异性，难以在形成初期精准诊断血栓。因此，提高成像的分辨率和精准度，实现连续性和实时性生物成像，逐渐成为医生和研究人员追求的目标。

MRI 在医学研究、临床诊断中是一个不可或缺的强大工具。伴随着造影剂的进一步研究与发展，MRI 在血栓成像方面彰显出非凡的潜力，其中以氧化铁和钆( Gd) 基材料最具代表。氧化铁纳米粒是 T1 或 T2 加权 MRI 制剂，其在相对较低的浓度和亚毫米区域也能够被检测到。该纳米粒通过靶向对其具有特异性的生物标志物，如活化的血小板，已被广泛研究用于血栓形成的分子成像。Gd 基材料是典型的 T1 加权 MRI 试剂，足够强度的 T1 缩短效应可以在斑块/血栓(明亮)与周围组织和血液(深色) 之间产生清晰的对比，故而其在血管斑块或血栓形成的成像中存在显著优势。

磁性纳米体系因其独有特性而被作为 MRI 造影对比剂。研究证实，褐藻糖胶能与活化血小板表面的P-选择素特异性结合。将褐藻糖胶与超小型顺磁氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO) 纳米颗粒( nanoparticles，NPs) 偶联，可获得弹性蛋白酶诱导大鼠肾下主动脉血栓模型的血栓病灶MRI。将能与血小板表面糖蛋白Ⅱb /Ⅲa 特异性结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环肽( cyclic arginine-glycine-aspartate，cRGD) 偶联到聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly ( lactic-co-glycolic acid) ，PLGA］修饰过的四氧化三铁( Fe3O4) -NPs 上，可实现大鼠腹主动脉血栓造影成像。将可剥离的钆( Gd) 层用能被凝血酶特异性裂解的短段( ThrPep)偶联到氧化铁纳米表面，并进一步用纤维蛋白结合肽修饰纳米结构，可得到血栓 MRI 多功能纳米传感器。该体系能够依据血栓形成时间及病灶凝血酶含量而特异性释放Gd，从而呈现 MRI 中 T1、T2 造影信号的切换，实现血栓类型的准确诊断。通过“点击反应”能与血小板表面糖蛋白Ⅱb /Ⅲa 特异性结合的单链抗体偶联到表面修饰有化学荧光基团的 NaGdF4-NPs 上，证实该结构具有优异的生物相容性，能快速靶向富集到活化血小板，实现血栓MRI和荧光双模成像。

临床上，CT 难以区分血栓结构及循环系统中的血液组分，因此无法实现精准诊断。一些含有高Z元素的组分，包括金( Au)、铋( Bi)、锆( Zr)、碘( I) 等具有很强的X 射线吸收能力， 可作为 CT 成像造影剂。乙二醇壳聚糖修饰的 Au( GC-Au) NPs可聚集在血栓部位增强病灶 CT 造影信号。纤维蛋白结合肽进一步修饰 GC-AuNPs 表面可得到功能化fib-GC-AuNPs， 研究结果表明，与非靶向的壳聚糖-金纳米粒( GC-Au NPs) 相比较，该靶向纳米粒( fib-GC-Au NPs) 能够在血栓部位高效蓄积。同时，在原位血栓形成、栓塞性梗死和治疗性溶栓的体内外模型中也证明了该靶向制剂的优越性。此外，使用 fib-GC-Au NPs 的 CT 成像可量化脑部栓块大小、实时监测组织型纤溶酶原激活剂( tissue type-plasminogen activator，rt-PA) 的溶栓效果。而且该成像纳米粒起效时间极快，静脉注射 fib-GC-Au NPs 5 分钟后，即可利用 CT 获得满意的成像效果。有学者设计了凝血酶响应的近红外荧光和 CT 双模成像分子探针( TAP-SiO2 @ AuNPs)，其在血栓病灶富集后能特异性地提供近红外荧光/CT 双重造影信号，从而实现早期血栓精准诊断。将能够特异性靶向纤维蛋白原的适配子分别与I-NPs及Au-NPs 偶联得到 I-FA 和 FA-AuNPs 两种靶向分子探针，两者均可在血栓处富集并增强病灶 CT 成像效果，而 FA-AuNPs 主要富集在血栓表面，I-FA 能够渗透进入血栓内部，从而提供整个血栓区域的 CT 造影信号，这可能是由于不同粒径及形貌特征 I-NPs 及 Au-NPs对 NPs 扩散性的影响所致。

超声因快速(实时监测)、安全(非侵袭、无放射)、廉价等优点被视为临床疾病诊断的首选辅助检查。但血管内循环组分，如红细胞、血小板等具有较高的超声背景信号，极大地限制了血栓病灶的准确诊断。研究发现，微气泡能显著增强超声造影信号，可将能与血栓特异性靶向结合的分子修饰到微气泡表面，有望克服血流剪切力，使微气泡富集在血栓部位，从而提高病灶区域的超声造影信号。有研究将聚合物微泡与褐藻糖胶偶联得到褐藻糖胶微泡，证实其能在大鼠下腔静脉血栓靶向富集并增强病灶区域的超声造影信号。将能与活化血小板表面糖蛋白Ⅱb /Ⅲa 结合的单链抗体与微泡偶联，获得靶向微泡，并证实靶向微泡可实现小鼠颈动脉血栓的快速成像，并能够实时监测血栓体积、评价溶栓治疗效果。

光声成像是一种新兴的生物医学成像方式，主要通过检测组织或造影剂吸收特定激光后产生的超声信号，实现体内特定区域的成像技术。利用两性分子二萘嵌苯-3，4，9，10-四羧酸二酰亚胺( perylene-3，4，9，10-tetracarboxylic diimide，PDI) 自组装成 NPs，并用cRGD进一步修饰可得到具有较好光声造影性能的功能化分子探针cRGD-PDI，在小鼠模型中，cRGD-PDI 能够依据血栓形成时间提供不同光声信号，实现新老血栓的区别监测。有研究将近红外荧光染料 IR780 和碳酸硼苄酯共价连接至硼化麦芽糊精中，该化合物可以自组装形成纳米粒(T-FBM)。为了靶向血栓部位，研究者将纤维蛋白靶向肽DSPE-PEG-CPPRPG修饰至纳米粒表面。苄基碳酸酯和IR780分别被用作 H2O2 触发的气泡生成部分和光吸收剂。当纳米粒到达富含 H2O2 的血栓部位时，T-FBM 经过多次反应后会产生羟基苯甲醇 ( P-hydroxybenzyl alcohol，HBA ) 和 CO2。HBA 具有抗氧化、抗炎和抗血小板活性，从而抑制血栓形成。与激光触发的可生成微泡的纳米液滴不同，T-FBM 纳米粒可以在没有气体前体和激光照射的情况下显示出明显的光声信号放大。即在 T-FBM 纳米粒给药后，通过光声成像可以清楚地区分三氯化铁( FeCl3) 引起的颈动脉损伤。将 Fe3O4-NPs、墨汁、PLGA 共同封装入聚多巴胺纳米壳中，并在其表面共修饰cRGD 和 P-选择素特异性结合肽没食子酸修饰的 EWVDV，获得双靶向功能纳米体系，结果证实，双靶向设计显著提高了高血液剪切力下纳米体系靶向结合血栓的能力，并能提供病灶区域光声成像/MRI 造影信号。

随着光学纳米探针的飞速发展，紫外线、可见光、红外线、荧光等光学设备在血栓诊断领域的应用引起了广泛关注。有学者设计了一系列荧光纳米金刚石颗粒( fluorescent nanodiamond particles，F-NDP)，随后与Bit( Bitistatin) 偶联形成功能化的近红外探针 F-NDP-Bit，其能与活化血小板上的纤维蛋白原受体特异性结合，实现血栓的红外成像。以介孔二氧化硅为模板，利用赖氨酸( K) 和聚谷氨酸( E) 将具有高度亲水性的脯氨酸( P) 、丙氨酸( A) 和丝氨酸( S) 交联构成具有高度生物安全性的纳米结构PASKE，其在循环系统中具有较长滞留时间，且极易被溶酶体降解，与单链抗体和荧光染料偶联的 PASKE 能在小鼠颈动脉血栓处靶向富集并呈现病灶荧光信号。首先将近红外荧光染料 IR820 和可清除 H2O2的硼酸盐连接至聚合物 fBAP 作为骨架，并在其表面修饰纤维蛋白靶向肽并载药替罗非班，可得到纳米探针FTIAN。在 FeCl3 诱发的动脉血栓小鼠模型中，FTIAN 进至血栓部位后可在此积聚，该纳米粒不仅能够产生强烈的荧光，并且还能提供明显的光声信号以实现实时成像。此外，该纳米探针可以清除血栓周围的活性氧( reactive oxygen species，ROS) 并结合替罗非班的抗血小板功能，发挥良好的血栓治疗作用。因此，FTIAN 具备诊断和治疗血栓的双重潜力。尽管分子探针的发展给血栓的光学/荧光成像带来新的机遇，但外源光线组织穿透性差等因素限制了其现阶段的应用，目前其仅用于检测近表层血栓，未来近红外二区成像的分子探针的开发将有望实现深层血栓的精准诊断。

随着分子影像技术的蓬勃发展，传统的单一成像模式很可能难以获得丰富的病变信息。因此，目前的研究主要集中在探索多模态成像方法上，例如将多种对比剂如X射线激发发光( X-rayexcited optical luminescence，XEL) 发射对比剂、近红外荧光团或放射性标记构建在同一体系形成多模态组合探针，以此将不同成像技术的优势结合起来，达到提高病灶的分辨率及改善探测敏感性的目的。这种多模态成像模式不仅可以诊断血栓性疾病，还能够评估血栓潜在的生物学特征，具有非常广阔的应用前景。

有学者开发了一种凝血酶激活的闪烁纳米探针，用于活体早期血栓形成的无背景XEL 成像。该研究通过染料标记肽的改性设计了明亮的XEL发射的掺镧闪烁体纳米晶体( NCs)，构建了纳米探针。这种纳米探针最初显示XEL-off，在凝血酶特异性肽裂解时会强力开启XEL，这归因于染料和 NCs 之间能量转移的合理控制。特别是，由于XEL成像具有较高的组织穿透深度和无背景特性，该策略在原位凝血酶水平升高的基础上实现了对早期血栓形成的高效XEL 成像。此外，XEL 和 MRI 功能可以集成在一起，以进一步提高成像准确性和监测血栓形成进展。

大多数血栓性疾病患者在发病前几乎无明显的临床症状，早期准确诊断血栓性疾病能有效延长治疗窗口期，为及时采取有效溶栓策略创造条件，从而避免后期发生危及生命的严重临床事件。因此，创新纳米技术开发靶向血栓标志物提高病灶区域造影信号的分子影像探针的研究具有重要意义。

参考资料 :

[1]李博,杨童,刘锦,等.纳米功能材料在血栓诊疗领域的研究进展[J].医学综述,2022,28(04):730-735.

[2]张洪源,孙胜男,王晨,等.新型纳米药物递送系统用于血栓诊疗的研究进展[J].沈阳药科大学学报,2022,39(06):760-772.

作者简介：

小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。