《iScience》杂志 2024 年3月 27日在线发表美国University of Wisconsin Madison School of Medicine and Public Health的Jack M Shireman , Quinn White , Zijian Ni ,等撰写的《用立体定向放射外科治疗的人脑转移瘤的基因组分析揭示基于治疗失败的独特特征。Genomic analysis of human brain metastases treated with stereotactic radiosurgery reveals unique signature based on treatment failure》（doi: 10.1016/j.isci.2024.109601.）。
立体定向放射外科(SRS)已被证明是有效的治疗局限性脑转移瘤(BM);然而，SRS对人脑转移瘤的影响还有待研究。我们对先前接受过SRS治疗的患者切除的脑转移瘤进行了基因组分析。我们的分析首次证明，患者具有基于治疗失败类型的独特基因组特征，包括局部失败、脑脊膜扩散和放射性坏死。对经SRS治疗的肿瘤的中心和外周边缘的检查表明，沿外周边缘的DNA损伤分布不同，肿瘤抑制基因突变和DNA损伤修复途径富集。此外，用于传递SRS的两种临床模式，LINAC和GK，即使在受控原发部位之间，也显示出对肿瘤景观的不同影响。我们的研究在人类中提供了SRS对不同BM的不同影响的生物学证据。
重点
•立体定向放射外科在人类肿瘤中产生显著的基因组损伤
•肿瘤外周边缘和中心核心的DNA损伤情况不同
•治疗失败的类型对应于独特的基因组特征
•LINAC和伽玛刀治疗方式丰富了不同的基因组特征
矛盾的是，最常见的脑肿瘤并非起源于大脑本身，而是系统性癌症的结果，每年大约有200,000例脑转移瘤(BM)被诊断出来。立体定向放射外科(SRS)已成为有限脑转移瘤(1-4个脑部病变)的主要治疗方式，因为它能够直接靶向肿瘤周围的辐射剂量，既可以保留正常组织，又可以提供更集中的辐射剂量。
目前，SRS治疗既被用作较小病灶的一线治疗，也被用作有症状脑转移瘤手术切除后的辅助治疗。在切除瘤腔内使用SRS治疗可显著降低局部复发率。临床前研究已经确定，放射治疗通过DNA损伤的物理积累发挥其作用，特别是引入单链和双链DNA断裂。此外，由于活性氧在肿瘤血管中的分布，辐射的致死效应会被放大。SRS有两种主要的递送方式，伽玛刀(GK)和直线加速器(LINAC)，在临床上它们被认为是可比较的，并且同样用于脑转移瘤治疗，尽管一些研究假设了两种方式之间的剂量差异。
迄今为止，对SRS的研究仅在临床前模型中进行，因此没有直接研究分析SRS治疗在人体体内的放射生物学效应。为了解决文献中关于辐射在人脑中的原位效应的知识差距，我们分析了一组独特的脑转移瘤样本，这些样本之前接受过SRS治疗，然后手术切除。这些样本包括所有主要类型的通常转移到大脑的癌症。用GK或LINAC治疗的样本，在这些样本中，从SRS治疗野的等剂量中心以及沿着SRS给量场的外围边缘获得组织。这组罕见的样本允许在天然中枢神经系统(CNS)微环境中调查辐射对人类脑转移瘤的直接影响。此外，可以比较通过LINAC或GK接受SRS的患者及其潜在的DNA损伤概况。
人体样本特征
在2018年3月至2022年5月期间，我们确定了34名患者，他们最初接受SRS治疗有限的脑转移瘤，随后接受了至少一个治疗脑转移瘤的手术切除。肿瘤标本快速冷冻保存，从肿瘤中心和外周边缘取活检。为了了解立体定向辐射在基因组水平上对人类中枢神经系统内肿瘤生长的影响，所有样本都通过全外显子组测序(WES)和RNA测序(RNAseq)进行了分析。在34个样本中，50%是女性。年龄范围从36岁到85岁(中位数:59岁)，85%的患者KPS为70或更高。在34例患者中，20例既往诊断为癌症，14例表现为早熟（precocious）脑转移(表S1)。原发癌类型包括肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肾癌、胃肠道和子宫内膜癌(图1A和1B)。
SRS治疗的剂量由LINAC或伽玛刀(GK)作为单次分割递送。在分析生物学相关性的患者样本中，34个样本中有3个(8%)来自局部失效(LF)患者，34个样本中有3个(8%)来自放射性坏死(RN)患者，34个样本中有3个(8%)来自柔脑膜失效(LMF)患者。LF、LMF和RN患者之间没有重叠。所有RN患者均采用LINAC治疗，所有LMF病例均为小脑转移瘤患者。肿瘤切除的决定是在与治疗神经外科医生协商后确定的，临床决策由患者特异性治疗小组承担。患者在手术切除前接受SRS治疗，术后定期随访诊断为LM或RN。在13例患者中，从外周和中心匹配的肿瘤中获得了足够的高质量RNA和DNA，而其他21例试验患者缺乏来自中心或外周样本的至少一种RNA或DNA成分。总的来说，所有34名患者至少有一个可用的测序数据组成部分(图1C)，这是通过广泛的质量控制指标确定的(图S1A-S1C)。此外，先前存档的未照射切除的肺癌脑转移瘤被单独获得，并作为对照进行比较。
立体定向放射外科包括DNA损伤，导致治疗肿瘤组织的全基因组转录组改变
辐射在阻止扩散，或在某些情况下消除脑转移瘤方面的生物学影响已被临床充分证明，然而，没有可用的数据分析人脑基因组水平上辐射引起的损伤。虽然辐射的目的是在肿瘤细胞中诱导不可逆的DNA损伤，导致肿瘤细胞死亡，但辐射对肿瘤细胞还有其他继发性影响，可以改变肿瘤细胞在体内的生物学特性。
为了准确描述SRS对脑转移灶造成的DNA损伤，并了解这种细胞损伤的可能功能结果，我们比较了来自切除的辐照过的脑转移灶的WES和RNAseq数据(图2A)。先前存档的未辐照切除的肺癌脑转移瘤作为对照进行比较。
DNA损伤(SNP, DNP, TNP，插入，缺失)的WES量化显示，接受SRS的肿瘤中总体DNA损伤急剧增加(图2B)(非辐射平均841个标记与辐射平均1849个标记，p < 0.001)，其中大部分损伤来自内含子区域内的SNP(87.24%)(图S2A和S2B)。SNPEFF22注释的高影响变异表明，在类型匹配的非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤中，高影响缺失和插入在辐射样本中更为普遍(Rad (12) vs.非Rad(5))平均检测到的高影响变异;缺失:36比18 p < 0.01，插入:17比9,p < 0.05)(图2C)。每条染色体的总变异数在每个样本的基础上可视化，表明所有样本中存在独特的DNA损伤模式(图2D)。基于每个样本的高影响突变的分层聚类也显示了患者样本之间的异质性(图S2C)。使用BCFtools23 vcfR、24和plotVCF对总辐射和非辐射样品创建基因汇总图，揭示变异沿染色体的差异分布(图2E)。
C>T单碱基取代(SBS)是辐射损伤的标志，15,25是我们样本中最普遍的SBS(图2F)，而原发性黑色素瘤引起的BM在每种辐射肿瘤类型中含有最高比例的SBS标记，这可能是由于病变倾向于先前的紫外线诱导辐射损伤(图2G)。
D>使用ALLEZ29对放射外科队列中存在的差异表达基因进行基因本体论分析，形成瀑布图(p < 0.05显著性水平，先前项排除)。结果表明，DNA损伤修复是最富集项，其他细胞生长过程如ATP依赖活性、中心粒形成和DNA复制调节也是最富集项(图2H和S2D)。使用DeSeq230对接受SRS或未接受SRS的类型匹配肿瘤进行差异表达分析，143个表达项富集(α-阈值<0.01)(图2I)。然后，从双链断裂和DNA修复基因中分离出有助于全局ALLEZ GSEA富集的基因，以可视化表达变化，证实放射肿瘤在LINAC和GK传递方式中的上调(图2J和2K)。
最后，对样本进行降维，然后进行基于UMAP的聚类，显示来自同一肿瘤(中心与周围)的样本适度聚类，但没有跨患者聚类(图S2E)。总的来说，这些数据表明，在人类中，SRS在不同原发部位的一系列转移性肿瘤中诱导可测量的和显著的细胞损伤。诱导细胞损伤的功能后果似乎是细胞修复的富集，这并不奇怪，因为癌细胞已被证明善于增殖，尽管细胞损伤或突变高于基线水平。
脑转移瘤的外周边缘显示DNA损伤修复和细胞生长基因富集的迹象，可能导致治疗失败
脑转移瘤起源于不同器官内生长的恶性肿瘤，因此必须嵌入并整合到外源中枢神经系统微环境中才能生长。由于这种生长的性质，主要由转移性癌细胞组成的肿瘤中心与转移性癌细胞与周围中枢神经系统微环境相互作用的肿瘤外周相比，具有不同的周围微环境。目前，还没有关于转移性病变中心和周围辐射的基因组效应比较的人类数据，这些转移性病变本质上具有不同的微环境相互作用(图3A)。我们使用WES和RNA测序检查了从BM的中心和外周边缘切除的肿瘤组织。共享变异与独特变异的量化表明，大多数变异在中心和外围样本中是常见的，然而，独特变异仍然占检测到的变异的大约20%(图3B和3C)。用SNPEFF和COSMIC39对变异类型进行分类表明，在中心和外围样本中存在相似数量的低、修饰、中等和高影响，同时也表明在现有的COSMIC数据库中不存在许多检测到的变异(~ 2/3)(图S3A和S3B)。中心和外围样本之间跨染色体位置的变异可视化显示，在单个染色体水平上(底部与顶部)可见不同变异位置的全局重叠模式非常相似(图3D)。对样本中每个基因变异的分析表明，样本对之间存在一致性，但原发肿瘤类型之间存在独特差异(图3E和S3C)。利用DIFFUSE40在中心和外围样品之间进行异构体富集，以便更深入地了解潜在生物学的转录图像。异构体富集表明，在同一肿瘤样本(图3F和S3D)中，中心和外周之间可能存在显著的转录变异，这在高级别胶质瘤生物学中可见，但尚未在脑转移瘤人群中描述。基因本体富集术语包括白细胞活化、细胞外基质和血管生成，显示了与骨髓外周边缘的微环境相互作用(图3G)。此外，外周样品中富集了DNA双链断裂加工，而中心样品中富集了凋亡信号(图3H)，这可能是由于SRS基于其与微环境的相互作用而对癌细胞的生物学作用存在差异。外周样本也有更多的带有注释的肿瘤抑制基因的突变(图3I)，可能增加了该区域内细胞的增殖能力，这可能导致治疗失败。
为了检查与周围脑和免疫细胞的相互作用，进行了FARDEEP45下放分析，结果表明外周样品富集兴奋性神经元细胞(图3J)，免疫入侵主要由巨噬细胞和浆细胞谱系(图3K)主导。中心和外周样本的免疫组化证实了我们的计算机研究结果，显示了强大的CD45+免疫细胞侵袭(图3L)(肺:中心与外周CD45+计数，n = min 100计数，p < 0.05)。
这些数据首次证明，脑转移瘤的外周边缘接受的辐射导致不同的基因组和转录组特征。SRS的这种差异影响与肿瘤中心和周围独特的微环境差异相结合，可能在促进细胞恢复、上调DNA损伤修复以及增加增殖能力方面发挥一定作用。这些生物学现象共同可能为治疗失败奠定了基础。
伽玛刀和直线加速器治疗方式在匹配的原发肿瘤类型中诱导不同的基因组特征和DNA损伤
临床认为GK与LINAC在疾病控制效果上是相等的。根据医疗地点现有的设施，这两种系统通常可以互换使用。然而，已知两种给量方式在剂量适形性、治疗时间、分割和单个等中心多靶向等方面存在技术差异（ technical differences between the two delivery types such as dose conformality, treatment times, fractionation, and single isocenter multitargeting）。
与LINAC相比，GK在SRS治疗病变的中心和周围存在一些剂量差异，其中剂量传递更为均匀。由于我们发现在SRS治疗的病灶的核心和周围有不同的生物学过程，为了描述不同的辐射剂量在病灶核心和周围的作用，我们分析了GK和LINAC治疗的原发性肺病变相互对照(图4A)。
使用PlotVCF合并染色体上的所有变异，我们观察到，与GK相比，使用LINAC治疗时，周围病变的损伤分布更大，而在BM的中心相似(图4B)。量化所有样本中高影响变异的总数显示，GK和LINAC之间没有统计学差异(变异的平均值为:GK: 707, LINAC:776, p < 0.15)，然而，当仅限于肺原发肿瘤引起的BM时，LINAC处理样本的变异有统计学意义的增加(变异的平均值:LINAC: 1142, GK: 387, p = 0.02)(图4C)。所有GK和LINAC患者的差异表达分析显示，172个差异表达基因的p值<0.05,FDR <0.10(图4D)。GK患者NXPE4和NOX1最富集(Log2FC: - 26.82， - 7.83 p < 0.0001)，而LINAC患者ACTN3, CT83和MAGEA10最富集(Log2FC: 22.36, 22.36, 21.79 p < 0.0001)。GSEA显示，在GK治疗的样本中，脂质转运和定位等术语显著富集，而在LINAC样品中，激素介导的信号传导和雄激素受体信号通路术语富集(图4E)。驱动这些激素相关LINAC富集的是几个癌睾丸抗原(CTA)基因，如TSPY3、PAGE5和DAZ1(所有基因的p-adj <0.00001)。利用人类蛋白图谱数据库获得这些基因的免疫组化切片，显示仅在健康个体的男性生殖系统中有显著表达(图4F)。尽管对CTA基因的功能尚不清楚，但它们可能参与肿瘤增殖和免疫反应，由于在生殖器官以外的正常组织中表达有限，许多抗原正在作为候选疫苗进行试验。这可能解释了在临床和临床前环境中观察到的放射和免疫治疗的协同作用。
原发肿瘤的位置和治疗失败的类型显示出不同的基因组图谱
正如目前的研究，以及我们的数据所表明的，转移并不都是平等的。为了进一步探讨这个问题，我们通过观察不同原发肿瘤类型中高影响缺失或插入的平均频率来检查原发肿瘤的位置。结果显示，肺脑转移瘤样本中缺失最多，而黑色素瘤样本中插入最多(图5A)。进一步强调原发肿瘤类型的差异，乳腺癌原发BM和肺原发BM(我们研究中最常见的两种样本类型)在RNA水平上表现出差异表达(1477个基因DE在α < 0.01)(图5B)。
利用定义主成分的UMAP基于基因表达对所有患者样本进行聚类，这表明患者之间存在相似性，但患者之间存在差异，即使相似类型的肿瘤也无法可靠地聚类在一起(图S4A-S4C)。对经常突变和差异表达的基因进行检查，发现38个基因(占样本结果的1%)符合这两种类型，有趣的是，一个共同的CENPB，一种促进着丝粒形成的蛋白质，出现在这些结果中，并且在所有经历局部治疗失败的患者样本中发生突变。为了验证计算机分析结果，对刺激(50Gy) A549原发性肺癌细胞或分离的外周和中心肿瘤样本进行了体外QPCR。在辐射的A549细胞中证实了CENPB, PSG1和POM12的富集(p < 0.0001, 0.5, 0.01)，以及POM121和SPINK13在周围样本中与中心样本相比的富集(p < 0.001, 0.001)(图s4 - s4f)。上调基因(obscurin， & usherin)的突变状态也被可视化，表明在中心样本中富集(图S4G和S4H)。这些基因都属于细胞分裂和复制高度富集的家族，进一步证实，在人类样本中，SRS治疗会造成可检测到的基因组损伤，破坏细胞分裂和增殖，最终可能导致治疗失败。
SRS治疗失败可以表现为被治疗病灶的LF、局部区域性LMF和RN。在所有分析的样本中，LF、LMF和RN患者各有3个样本。所有群体采用Deseq2差异表达(DE)分析进行比较，保留通过p < 0.05和FDR<0.10截断点的DE基因。LF中共鉴定出1677个基因，RN中鉴定出500个基因，LMF中鉴定出339个基因(均α < 0.10)。3组间共有7个基因(MAGEA10、KRT17、COL22A1、ACSM2A、TSPY3、BCAR4和CT45A3)(图5C)。过度代表性分析没有发现这个小基因集的显著富集，这表明这些条件之间不太可能存在泛基因特征，而是指向每个分子异常的独特特征。为了单独探讨每种情况，对所有3种情况下的每个DE基因集进行GSEA，并显示每种治疗并发症的独特特征(图5D-5F)。
LF患者表现出RNA生物学过程的高富集以及突触信号传导和形成的抑制(图5D)。RN患者代谢途径丰富，同时细胞分化和发育受到抑制(图5E)。
最后，LMF患者细胞周期过程、RNA剪接和磷酸化富集，同时抑制自噬和酶结合(图5F)。
总的来说，这些数据表明，尽管在这些条件(细胞周期加工、核糖体激活和生物发生)之间有一些共同的途径重叠，但大多数基因表达变化是独特的，可能需要有针对性的治疗干预，而不是广泛的治疗干预。
讨论
对经SRS治疗的脑转移瘤的基因组分析为辐射对人类中枢神经系统内肿瘤的影响提供了重要的见解。虽然有大量的文献分析脑转移瘤的基因组图谱，但辐射肿瘤的人类遗传数据尚未被检查或发表。在这项研究中，我们提供了第一个研究SRS治疗对BM的基因组效应的人类数据集。与先前使用体外人细胞和小鼠肿瘤模型的研究结果一致，我们表明SRS治疗在BM患者接受治疗后诱导了显着的基因组变化。
我们的研究结果表明，这些主要由SNP驱动的遗传变化可以在剂量和切除之间的1天和4天内在RNA和DNA中检测到，尽管损伤可能持续更长时间。有趣的是，最终出现某种形式的治疗失败的患者在SRS治疗后有一个明显的基因组特征。在其他未经放射治疗的BM的大型基因组分析的背景下，我们的研究结果发现了常见和独特的突变(TP53共性，CENPB辐射特异性)，表明生物学上的SRS提供了独特的进化选择压力，可能通过肿瘤抑制基因的进一步突变被利用。
在我们的样本中，我们还发现了类似的基因上调，如MYC和AKT，这在其他研究中报道了治疗前后的BM在本研究中还注意到，治疗前后BM的基因组没有大的变化，这可以解释我们在中心和周围肿瘤位置之间的微小基因组变化的类似结果此外，由于大多数BM患者之前都接受过某种类型的全身癌症治疗，因此很难将突变或基因组改变特异性地归类为单一治疗。随着该领域的发展，这将需要在治疗的各个阶段检查肿瘤，并在患者之间比较相似的医疗方案标准。
我们的研究结果还强调了来自不同系统部位的原发肿瘤的脑转移的异质性。尽管一些全身性肿瘤，如肺癌或乳腺癌更有可能转移到大脑，但我们仍然在我们的数据集中发现了它们之间显著的基因组差异。这种异质性在我们的样本中可能没有得到充分体现，未来需要更大规模的研究来充分弄清楚是否共享的基因组程序驱动所有脑转移，或者是否特定的原发肿瘤依赖特定的生长信号来完成向大脑的转移。这可能需要多机构合作，以获得更大的样本量，特别是更罕见的原发性癌症(如肾脏、胃肠道)的转移。
我们的研究结果首次在人类身上证明，临床将SRS输送到BM的中心和周围具有不同的遗传效应。这种辐射诱导损伤的差异效应导致病变周围DNA损伤修复通路的上调，这可能导致手术期间活肿瘤细胞播散导致的脑膜柔脑膜失效的发展，以及SRS剂量和临床切除术后的局部失效。
我们认为，与脑转移病灶周围直接接触的复杂中枢神经系统微环境可能在这种独特的遗传效应中发挥了重要作用。此外，我们还表明，辐射对不同类型的癌症有不同的影响，这很可能会推动未来针对不同类型癌症的靶向治疗和治疗方式的结合。我们的结果提供了目前放射生物学领域缺乏的重要生物学背景，并强调了考虑患者肿瘤基因组学设计更细致和有针对性的临床试验的必要性。
我们的研究中最发人深省的发现之一是GK和LINAC在基因组图谱上的差异，这两种基因在临床上被认为是可互换的，就其治疗脑转移瘤的能力而言，在匹配的原发性肿瘤中。我们发现，在LINAC治疗的病变中，而在GK治疗的病变中，CTA基因富集，这正成为免疫治疗的一个日益常见的靶标。
这一数据引出了一个问题:在联合免疫治疗试验中协同使用LINAC是否会是一种更好的放疗递送方式?我们的数据为提出这些关键问题提供了生物学基础，这些问题不仅可以改善脑转移瘤患者的临床试验，还可以外推到原发性脑肿瘤患者。
总的来说，我们的样本产生了一个独特的辐射脑转移的人类数据集，迄今为止尚未收集或研究。此外，通过先进的SRS治疗的人类癌细胞体内测序技术分析DNA和RNA是对文献的新贡献，并为人类大脑放射生物学提供了新的见解。
本研究的局限性
尽管这项研究很新颖，但它也有局限性。我们的总体样本量很小。脑转移瘤样本来自几种不同类型的原发性癌症患者，因此每种癌症亚型的代表并不均等，导致对肺癌的偏向。因此，这些发现在不太常见的原发癌症中的普遍性需要进一步探索。在我们的外显子组分析中，缺乏生殖系基因组对照样本和原发癌症样本也限制了我们得出与癌症直接克隆跟踪和基因组进化相关的结论的能力。
结论
总之，我们得出结论，辐射效应在DNA和RNA水平上都是明显的。辐射的生物学效应取决于癌细胞的位置及其与中枢神经系统微环境的接近程度，这可能反过来导致治疗失败。在我们的样本中，每种类型的治疗失败都显示出不同的基因组特征。在正在进行的大型试验中，在更大的患者队列中进一步验证这些特征，可以对患者进行临床分层，并针对预测的失败类型开发靶向联合治疗。
GK和LINAC的SRS递送方式产生不同的基因组特征，而LINAC产生的CTA可能比GK提供更好的免疫治疗协同作用。这些结果为围绕SRS在BM中的应用提出新的临床问题提供了支持，并为下一代临床试验的更明智的设计奠定了基础。
