文章来源：《国际内分泌代谢杂志》2024年5月第44卷第3期
摘要
目的 探索中医药抗糖尿病肾脏病（DKD）的用药规律和作用机制，并通过动物实验验证。
方法 收集中医药抗DKD的文献报道，提取方药信息，筛选高置信度和支持度药物组合作为新方，并获取新方的活性成分及作用靶点；从GEO数据库获取DKD相关的数据集GSE30122和GSE30529，联合加权基因共表达网络（WGCNA）和机器学习鉴定新方抗DKD的关键基因（hub genes），并验证hub genes的表达差异。
结果 药物组合“黄芪-丹参-山茱萸”作为新方，涉及靶点1 378个，基于GSE30122和GSE529，进一步获得新方与疾病共同作用靶点19个，作用靶点主要富集于Hippo信号通路、环磷酸鸟苷/蛋白激酶-G信号通路等；最终筛选出2个hub genes：EDNRA和HDAC9。与对照组相比，hub genes在模型组具有更高的表达，且肾组织损伤更甚；经新方干预，治疗组有效降低了hub genes的表达量，且肾组织较模型组改善。
结论 “黄芪-丹参-山茱萸”作为新方，可能通过EDNRA和HDAC9，调节Hippo、cGMP-PKG等信号通路抑制肾损伤，进而发挥DKD的治疗作用，为后续治疗DKD的药物开发和临床应用提供理论基础。
前言
糖尿病肾脏病（DKD）作为2型糖尿病最常见和最严重的慢性并发症之一，在我国糖尿病人群中，患慢性肾脏病（CKD）人数已高达2 430万［1］，且预计DKD的患病率将逐年增加［2-3］，临床上DKD的防治方法局限于降压、纠正糖脂代谢紊乱、减少尿蛋白等，由于缺乏针对性治疗，患者仍不可避免地进入透析阶段，亟需发掘切实有效的干预手段。近年来中医药凭借“多靶点-多层次”的优势，在DKD治疗领域也展现出光明前景［4-5］。
数据挖掘技术广泛应用于中医药领域，通过收集20年来DKD中医药治疗的文献报道，挖掘高置信度和支持度药对作为DKD治疗新方，通过联合网络药理学、生物信息学分析进一步探讨新方的作用机制，并通过动物实验证实。
资料与方法
结果
2.1 复方收集及筛选
检索得到原始文献2 346篇，根据纳排标准复筛，剔除2 068篇，最终筛得278篇，共计396味中药，提取频次排名前20的中药称为高频药物，通过Apriori算法进行关联性分析，药对“黄芪-丹参-山茱萸”最具说服力（置信度=90.35，支持度=24.24），作为新方。
2.2 新方活性成分及作用靶点
检索TCMSP数据库，获得山茱萸有效化学成分14种、丹参58种、黄芪19种。检索BATMAN数据库，获得丹参24种、黄芪39种、山茱萸25种。将活性成分的作用靶点合并去重，共计得到1 378个靶点。
2.3 加权基因共表达网络分析
基于GSE30122数据集，当软阈值β=8时构建无尺度网络，其中brown模块与DKD的关系最大（cor=0.3，P=0.01＜0.05），提取brown模块基因554个。同理，基于GSE30529数据集，当β=15时构建无尺度网络，blue模块与DKD患病关系最大（cor=0.69，P=0.000，P＜0.05），提取blue模块基因736个。
2.4 GO和KEGG通路富集分析
通过韦恩图获得新方与DKD的交集靶点19个，视其为作用靶点。可见作用靶点主要富集于应激反应等生物过程（BP），见图1A、囊泡等细胞组分（CC），见图1B，钙依赖型蛋白构建等分子功能（MF），见图1C，以及Hippo信号通路等KEGG通路，见图1D。
2.5 PPI网络构建
将19个作用靶点及对应的中药成分导入Cytoscape软件进行网络拓扑分析，根据度值（Degree）排名前三获取有效活性成分丹参酚醌Ⅰ（Miltionone I）、刺芒柄花素 （formononetin）、黄芪甲苷（Polygalacic acid）。随后将作用靶点导入STRING数据库构建PPI网络，基于“MCODE”算法，得到最优子网络（score=4），包括EDNRA、SNAI2、HDAC9、MEF2C关键靶点，视为hub genes。
2.6 预测模型构建及性能评估
EDNRA（OR=1.312，95% CI：1.104～1.560，P=0.006）；（OR=1.128，95% CI：1.006～1.265，P=0.043）及HDAC9（OR=1.736，95% CI：1.489～2.025，P＜0.001）；（OR=1.470，95% CI：1.275～1.696，P＜0.001），分别在GSE30122和GSE30529均为危险因素，且在DKD组均具有更高的表达水平（P＜0.05）。以GSE30122为训练集，基于hub genes构建临床预测模型，通过内部验证证实具有优秀的预测性能（AUC：0.983，95% CI：0.925～1.000）；基于GSE30529进行了模型外部验证证实具有良好的预测性能（AUC：0.806，95% CI：0.661～0.923）。
2.7 Hub genes转录组验证
与对照组相比，模型组hub genes转录水平更高（P＜0.05）；与模型组相比，治疗组hub genes转录水平更低（P＜0.05），结果见图2。
2.8 Hub genes翻译组验证
与模型组相比，治疗组hub genes表达量均明显降低，该趋势与qPCR结果一致。说明hub genes是DKD的危险因素，而治疗组有效降低hub genes水平，结果见图3。
2.9 HE染色
与对照组相比，模型组肾间质小血管破裂，肾小球与间质距离改变且破裂，大量细胞流出；经中药干预后，治疗组细胞的结构和数量与模型组相比较，均得到明显改善，结果见图4。
2.10 血糖检测
与对照组（12.89±0.73）相比，治疗组（11.19±0.66）血糖降低（P＜0.05），模型组（14.49±0.57）血糖升高（P＜0.01）；与模型组相比，治疗组血糖降低（P＜0.01）差异有统计学意义。
讨论
数据挖掘集合了文本挖掘、数理统计、关联规则等多种分析方法，为实现对“病-证-方-药”的深度挖掘提供了可能［8］。不仅如此，网络药理学作为药物研究的新模式，二者的有机结合发掘了中药复方规律及干预机制。本研究发现，新方“黄芪-丹参-山茱萸”在治疗DKD最具有代表性。黄芪味甘，性微温，有“补气诸药之最”之称，其扩张肾血管的功效已被临床公认，能实现对肾的保护作用［9］。丹参作为活血化瘀之圣药，《医学入门》记载:“消者，烧也，熏蒸日久，气血凝滞。”借此指出了消渴燥热灼肾，清热散瘀是其治疗的关键环节。国医大师张大宁教授［10］认为DKD症状缘于糖尿病日久，正气亏虚，肾气不固，微精外泄，故而发为蛋白尿，运用山茱萸以补肾摄精，充固肾气，安和五脏，其收涩之法可改善尿频、尿浊、蛋白尿。
富集分析发现，新方可能通过调控Hippo信号通路、环磷酸鸟苷/蛋白激酶-G（cGMP-PKG）信号通路等多条通路，达到改善/治疗DKD的目的。研究表明，Hippo通路在高糖条件下受到抑制，从而激活Yes相关蛋白（YAP）并促进肾小球系膜细胞（MC）异常增殖，而MC异常增殖在糖尿病肾小球硬化的进程中起重要推动作用［11-12］。哺乳动物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4（MST1）是参与Hippo信号通路的核心成分，Yang等［13］发现，由MST1抑制诱导的活化YAP通过与转录增强缔合域蛋白（TEAD）结合并形成YAP-TEAD异二聚体直接上调TEAD激活，从而导致肾小管上皮中上皮-间充质转化（EMT）和纤维化。通过抑制YAP/TAZ活性，不仅可以阻断TGF-β诱导的肾成纤维细胞中的Smad 2/3信号传导，还可以阻断体内肾纤维化的进展［14］，为DKD治疗开拓了新的前景。高葡萄糖条件可促进晚期糖基化终产物（AGE）积累，从而下调NO依赖性cGMP的表达并抑制cGMP-PKG信号通路［15］。Maimaitiyiming等［16］发现增加cGMP和PKG活性可增加肾小管直径，减少巨噬细胞管浸润，并减少肾小管TGF-β诱导的纤维化和凋亡，对改善DKD预后具有良好前景。
Qi等［17］研究发现，肾小球内皮线粒体功能障碍与肾小球内皮素-1受体A型（EDNRA）表达增加和循环内皮素-1（EDKD1）增加有关。通过选择性阻断EDNRA或靶向活性氧清除作用于线粒体，可以预防内皮细胞的线粒体氧化应激，并改善糖尿病引起的内皮损伤、足细胞丧失、白蛋白尿和肾小球硬化。HDACs介导DKD的发病和进展，在肾间质成纤维细胞和肾小管上皮细胞中引发成纤维细胞活化、增殖和趋化因子生成［25］，在DKD中起着重要作用，但仍须进一步实验证实。
综上，“黄芪-丹参-山茱萸”作为新方，可能通过EDNRA和HDAC9，调节Hippo、cGMP-PKG等信号通路抑制肾损伤，进而发挥DKD治疗作用，为后续治疗DKD的药物开发和临床应用提供理论基础。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献 略
END
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