Molecular mechanisms of aroma persistence: From noncovalent interactions between aroma compounds and the oral mucosa to metabolization of aroma compounds by saliva and oral cells

Carolina Muñoz-González, Marine Brule, Christophe Martin, Gilles Feron, Francis Canon

Centre des Sciences du Goût et de l’Alimentation, UMR1324 INRAE, UMR6265 CNRS Université de Bourgogne, Agrosup Dijon, F-21000 Dijon, France

Received 12 June 2021, Revised 20 October 2021, Accepted 21 October 2021, Available online 27 October 2021, Version of Record 7 December 2021.

https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.131467

重点发现：

1、芳香化合物能够在体外与粘膜膜相互作用。

2、口腔细胞和唾液在体外代谢特定的香气化合物。

3、由口腔细胞和唾液代谢的香气化合物在体内的持久性较低。

4、人体生理是香气持续现象的一个关键参数。

摘要

图2A显示，与对照相比，MP的存在显著降低了所有化合物的释放(芳樟醇26%，壬烷-2-酮 24%，戊烷-2-酮 7%，己烷-2,3-二酮66%，辛醛86%)。己烷-2,3-二酮和辛烷也受到口腔细胞状况的显著影响，这种减少在MP条件下对这两种化合物更为关键。这些作用可能主要由两种机制引起：(i)有或没有MP的口腔细胞表面之间的非共价相互作用或(ii)化合物的代谢。香气化合物与唾液蛋白(如粘蛋白)之间的非共价相互作用被认为涉及疏水效应。我们将之前HS分析的结果绘制为香气化合物极性(log P值)的函数，以检验第一种机制(图2B)。考虑到所测定的五种香气化合物，没有观察到相关性。这一结果表明，MP的滞留不仅仅是由疏水效应驱动的。此外，HS数据作为香气化合物挥发性(沸点值)的函数的绘图中没有观察到趋势(图2C)。然而，值得注意的是，两种化合物(己烷-2,3-二酮和辛醛)与其他三种化合物(芳樟醇、壬烷-2-酮和戊烷-2-酮)的表现非常不同。有趣的是，这两种化合物是唯一受到细胞状况显著影响的化合物。

为了深入探讨口腔黏膜对香气化合物的影响，我们对孵育样品进行了有机溶剂液/液萃取，因为这种萃取打破了香气化合物与MP之间的非共价相互作用(尤其是疏水作用)，同时提取了孵育后留在液相中的香气化合物。结果如图2D所示，其中芳樟醇、壬烷-2-酮或戊烷-2-酮在三种检测条件下没有显著差异，而己烷-2,3-二酮和辛醛在有或没有MP的口腔细胞存在下的回收率明显较低。与之前在MP存在下的顶空分析中观察到的减少相比，在三种分析条件中没有发现芳樟醇、壬烷-2-酮或戊烷-2-酮的显著差异，这一事实表明图2A之间观察到的差异。可以归因于加入有机溶剂(二氯甲烷)后，香气化合物和MP之间的非共价相互作用被破坏。MP含有不同的粘蛋白，如MUC1, MUC5B和MUC7，而香气化合物和粘蛋白之间的体外相互作用已被几位作者报道。研究表明，粘蛋白可以通过非共价相互作用(包括疏水作用)保留芳香化合物，这种相互作用可以被有机溶剂解离。然而，这些结果与先前使用类似粘膜模型获得的结果形成对比，在该模型中，未观察到MP对平衡状态下香气化合物的影响(Ployon et al.， 2020)。在之前的研究中，我们使用了离心唾液来形成MP，而在本研究中，我们使用了全唾液(富含黏蛋白等高分子量蛋白质)。这种分化可能增加了可用的结合位点，从而保留了香气化合物。此外，MP的组成取决于用于重组MP的唾液。在本研究中，我们分析了16个不同受试者(>70 y/o)唾液样本重建的粘膜模型，这也可能影响MP的组成。

另外两种化合物，己烷-2,3-二酮和辛醛，在模型粘膜样品(细胞和MP)中的回收率明显低于对照组。正如之前在口腔黏膜模型中观察到的那样，在口腔细胞存在的情况下，这两种化合物的液相浓度降低可能是由于这些芳香化合物被口腔细胞代谢所致(Ployon et al.， 2020)。

因此，目前的结果表明，虽然MP对所有测定的香气化合物都有化合物依赖的保留作用，但只有两种(己烷-2,3-二酮和辛醛)在口腔细胞的存在下被代谢。

图3所示。随着时间的推移，在对照、细胞和整个唾液样本中鉴定出的化合物为(A)芳樟醇，(B)壬烷-2-酮，(C)戊烷-2-酮，(D)辛醛和(E)己烷-2,3-二酮。数据表示为原始化合物与对照中0时获得的浓度的相对百分比，以及其代谢物的相对面积。所有结果均以平均值±SD表示。(F)体外培养过程中观察到的香气化合物减少示意图。

正如前面的实验(图2)所观察到的，无论测试条件(对照，细胞和全唾液)如何，随着时间的推移，芳樟醇(图3A)和戊烷-2-酮(图3C)的回收率保持不变，这表明这些化合物不会被口腔细胞或唾液代谢。口腔细胞条件下壬烷-2-酮的回收率高于对照组和唾液条件，孵育10分钟和30分钟后。在对照和唾液条件下，壬烷-2-酮的浓度随着时间的推移而下降(图3B)。尽管壬烷-2-酮在细胞条件下的回收率比对照组高得惊人，但先前有报道称，在口腔细胞中，该化合物的含量会减少(Ployon等人，2020)。因此，在三种条件下(对照、细胞和唾液)检查相应壬烷-2-醇的形成(图3B)。在细胞条件下，壬烷-2-醇在30分钟的孵育时间后开始被检测到，而在唾液的情况下，它只在120分钟被检测到。然而，在对照条件下壬烷-2-酮的减少不能归因于酒精的减少，因为在对照中没有检测到壬烷-2-醇。因此，在目前的实验条件下，壬烷-2-酮似乎不受代谢的影响。随着时间的推移，辛烷-2,3-二酮和己烷-2,3-二酮影响了它们在口腔细胞和整个唾液中的恢复(图3D, E)。这两种化合物浓度的降低表明，己烷-2,3-二酮和辛烷-2,3-二酮被唾液和口腔细胞酶代谢。此前已经在唾液存在下观察到二酮和醛的体外代谢(Buettner, 2002b, Muñoz-González等人，2018,Muñoz‐González等人，2019)或细胞酶(Robert-Hazotte等人，2019,Schoumacker等人，2016,Zaccone等人，2015)以及口腔和鼻腔内的体内代谢(Ijichi等人，2019)。对于辛烷醇，在两种条件下(细胞和全唾液)都观察到不同水平的辛烷-1-醇的形成(图2D)。这种酒精在唾液中的形成比在口腔细胞中要高，而辛烷醛的减少在两种情况下是相似的。对于己烷-2,3-二酮(图2E)，在细胞和全唾液条件下观察到3-羟基己烷-2-酮和2-羟基己烷-3-酮的形成，而己烷-2,3-二酮在口腔细胞存在下的消失率高于唾液。

在所有情况下，观察到的反应都对应于从醛和酮中还原羰基(图3.F)，从而产生与初始化合物相比具有不同感官特性(描述符或气味阈值)的代谢物。由于空间和电子效应，醛类通常比酮类更容易发生亲核取代，而二酮类有两个羰基。因此，己烷-2,3-二酮和辛醛是活性化合物，生物体可能通过其代谢来中和。这些反应可以通过一系列被称为气味代谢酶的酶(Heydel et al.， 2016)来进行，这些酶属于异种代谢酶家族。在不同的口服成分(口腔细胞与唾液)存在下，化合物的不同代谢可能是由于不同的因素，例如口服成分的酶活性，这取决于酶及其浓度，但也取决于辅酶因子的存在(Schwartz, Neiers, Feron， & Canon, 2021)等。

总之，这些实验证实了口腔细胞和整个唾液可以根据其结构在体外代谢香气化合物。因此，可以假设，与其他在口腔通道中不被代谢的化合物相比，己烷-2,3-二酮和辛醛的口服代谢可以降低它们在呼吸中的持久性。

图4所示。用PTR-TOF-MS测量了54名受试者在饮用了含有五种香气化合物的溶液后的体内香气持久性。值以百分比表示，考虑前30秒的AUC为100%，并计算其余监视时间相对于它的比率。低于100%的比例表明香气持久性随着时间的推移而降低。柱状图的结果以平均值±SD表示。不同字母表示应用Tukey检验后不同条件之间的显著差异(p值< 0.001)。

正如预期的那样，一旦样品被吞下，所有化合物的香气持久性都会逐渐减少(图4)。减少的程度取决于化合物，并且化合物在个体鼻腔中的消失速度不同。从第二个时间间隔(30-60 s)开始，化合物之间的差异显著，芳樟醇是最持久的化合物，其次是壬-2-酮和戊-2-酮。在第二次监测时间间隔(30-60秒)，记录这三种化合物在呼吸中的浓度分别为61%、41%和35%。如上所述，己烷-2,3-二酮和辛醛在呼吸中的持久性较低，在此监测时间它们的浓度分别为初始浓度(10 -30s)的19%和12%。从第三个时间间隔(60 ~ 90 s)开始，壬-2-酮和戊-2-酮之间存在显著差异，前者比后者更持久。在最后一个监测时间间隔(t120-150 s)，壬-2-酮和芳樟醇浓度仍占第一个监测时间间隔的20-27%。戊-2-酮占13%，而己烷-2,3-二酮和辛醛在同期呼吸中几乎消失(<4%)。因此，芳樟醇、壬-2-酮和戊-2-酮在受试者呼吸中的持久性明显高于己烷-2,3-二酮和辛醛。这些结果与体外口服成分(口腔黏膜模型、MP和唾液)的观察结果一致。在体内实验中，不易代谢的化合物(芳樟醇、壬-2-酮和戊-2-酮)显示出较低的衰变率，并且是受试者呼吸中最持久的化合物。因此，MP在体外实验中显示出显著的保留率(芳樟醇:26%;壬-2-酮: 24%;戊-2-酮:7%)，与它们的疏水性值(芳樟醇:logP 2.97;壬-2-酮: logP 2.70;戊-2-酮: logP 0.75)。这种行为在体内得到了维持，这表明它们通过与MP的疏水相互作用而保留在口腔中。此外，这两种化合物在体内被口服成分代谢后，体内持久性最低。然而，这两种活性化合物的行为相似(辛醛和己烷-2,3-二酮)，尽管它们在疏水性方面存在差异(分别为log P 2.80和- 0.35)。

从PTR-MS获得的释放曲线中提取先前体外实验中报道的代谢物(99.1羟基己烷-酮和113.1辛烷-1-醇)对应的m/z，以检查香气化合物是否在体内发生代谢。它们与己烷-2,3-二酮和辛醛的值一起绘制，以单位时间释放的香气百分比表示(图A.3)。由于溶液一旦被吞下，代谢物的形成将取决于口腔中原始香气的剩余量，因此代谢物形成对应的数据表示为每个分析时间点的代谢物百分比与释放的原始化合物百分比之比(图A.4)。代谢物的比例随着时间的推移而增加，这将支持这些化合物在体内的代谢。

总体而言，这些结果突出表明，香气的持久性不仅依赖于芳香化合物的物理化学性质，如疏水性和挥发性，如先前提出的(Buffo等人，2005年，Hodgson等人，2004年，Linforth和Taylor, 2000年，Normand, 2004年，Sánchez-López等人，2016年)，还依赖于香气化合物的代谢。虽然最近有报道称logp与香气释放之间缺乏一致性(Ployon et al.， 2020)和体内(psamrez - jimsamnez et al.， 2021)，但这是第一个证明香气化合物代谢影响香气持久性的实验工作。

图5所示。通过动态感官分析测定了26名受试者在食用两种溶液后的体内香气持久性，一种是芳樟醇(花香)，另一种是己烷-2,3-二酮(黄油香)。值表示为考虑第一次监视时间(5秒)为100%的持久性百分比，并计算其余监视时间相对于它的比率。低于100%的比例表明香气持久性随着时间的推移而降低。柱状图的结果以平均值±SD表示。不同字母表示应用Tukey检验后各条件间差异显著(p值< 0.05)。

正如在仪器PTR-MS实验中观察到的那样，一旦样品被吞下，两种化合物的香气持久性都会逐渐下降(图5)，尽管下降的程度与化合物有关。因此，从样品吞咽后60 s的监测时间开始，黄油香(由己烷-2,3-二酮引起)的持久性显著低于花香(由芳樟醇引起)(p < 0.05)，证实了之前的仪器研究结果。然而，有趣的是，在仪器实验中，化合物之间的差异比在感官实验中要大。不同的原因可以解释这一事实。首先，很难将人鼻子的敏感性与PTR-MS的敏感性进行比较。感官研究的复杂性更高，除了需要口腔加工，还需要大脑中信息的整合，这意味着参与者之间的个体差异甚至更大。

此外，感官试验方案(香气浓度、漂洗时间、持续时间等)的细微差异可能会影响结果。因此，在仪器实验中，参与者被要求冲洗口腔30秒，而在感官实验中，冲洗时间只有5秒，这可能会影响口腔中香气化合物的代谢和/或保留。此外，正如Ijichi及其同事对其他香气化合物的研究结果所表明的那样，由己烷-2,3-二酮还原产生的代谢物可能有助于个体的整体感知(Ijichi et al.， 2019)。他们发现，体内产生的香气化合物的代谢物被认为是原始香气的香气质量的一部分。虽然形成的代谢物通常比原始化合物呈现更高的气味阈值，但它们的形成可能在某种程度上有助于香气的持久性。

结论

本研究表明，香气持续是一种复杂的现象，涉及口腔黏膜和唾液的反应性，并依赖于香气化合物的结构。重点介绍了两种不同的机制。第一种机制涉及粘膜膜，覆盖口腔粘膜的薄层蛋白质，以及香气化合物对这种生物结构的亲和力。这种亲和性似乎取决于香气化合物的疏水性，这表明与唾液粘蛋白的疏水作用有关。因此，对粘膜膜具有高亲和力的香气化合物可以在吞咽后口腔内热力学平衡发生变化后，先吸附在口腔黏膜表面，再被解吸。第二种机制涉及口服酶的反应性，如外源代谢酶，对芳香化合物。因此，虽然香气持久性的机制涉及香气化合物在口腔黏膜表面的吸附，作为其亲和力的功能，但由唾液和口腔细胞代谢的香气化合物的持久性不如未代谢的化合物。

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