基础概念
| 技术名称 | 全称 | 基本原理 | 应用 | 定性/定量 |
|---|---|---|---|---|
| PCR | 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction) | 通过DNA聚合酶扩增特定DNA片段，包括变性、退火、延伸三步骤。 | DNA扩增、基因克隆、遗传分析等。 | 定性 |
| RT-PCR | 逆转录PCR (Reverse Transcription PCR) | 通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，再进行PCR扩增。 | 基因表达研究、病毒检测。 | 定性 |
| qPCR | 定量PCR (Quantitative PCR) | 在PCR过程中使用荧光染料或探针，实时监控DNA扩增。 | 基因定量分析、病毒载量检测、突变检测。 | 定量 |
| qRT-PCR | 定量逆转录PCR (Quantitative Reverse Transcription PCR) | 结合RT-PCR和qPCR，先将RNA逆转录为cDNA，再进行实时定量扩增。 | 基因表达定量分析、RNA定量。 | 定量 |
详细工作原理
PCR (Polymerase Chain Reaction)
步骤：
变性：将双链DNA加热至约95°C，使之解链为单链。
退火：降低温度至50-65°C，引物与目标序列结合。
延伸：在72°C下，Taq聚合酶从引物处开始延伸新链。
应用：适用于扩增特定的DNA片段，广泛用于基因克隆、遗传检测。
RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
步骤：
使用逆转录酶将RNA转化为互补DNA（cDNA）。
进行传统的PCR扩增。
引物：常用寡聚dT引物和随机六聚体引物，以保证RNA的全面转录。
应用：研究基因表达，检测RNA病毒（如HIV、COVID-19）。
qPCR (Quantitative PCR)
原理：
在扩增过程中加入荧光染料（如SYBR Green）或特异性探针（如TaqMan探针），荧光信号随着DNA的扩增而增加。
使用Ct值（阈值循环数）来定量分析，Ct值越小，样本中的DNA浓度越高。
步骤：
扩增DNA片段，同时实时监测荧光信号。
通过Ct值计算样本中的DNA初始量。
应用：病毒载量检测、突变分析、基因拷贝数研究。
qRT-PCR (Quantitative Reverse Transcription PCR)
原理：结合RT-PCR与qPCR的原理，先将RNA逆转录为cDNA，再进行qPCR的实时定量扩增。
步骤：
使用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA。
通过qPCR技术对cDNA进行实时定量扩增。
技术对比表
| 对比项目 | PCR | RT-PCR | qPCR | qRT-PCR |
|---|---|---|---|---|
| 模板 | DNA | RNA | DNA | RNA |
| 关键酶 | Taq DNA聚合酶 | 逆转录酶 + Taq DNA聚合酶 | Taq DNA聚合酶 | 逆转录酶 + Taq DNA聚合酶 |
| 扩增检测方式 | 通过凝胶电泳等检测PCR产物 | 通过凝胶电泳等检测cDNA扩增产物 | 实时荧光监测DNA扩增 | 实时荧光监测cDNA扩增 |
| 引物 | 正向引物 + 反向引物 | 寡聚dT引物 + 随机六聚体引物或特异性引物 | 正向引物 + 反向引物 | 寡聚dT引物 + 随机六聚体引物或特异性引物 |
| 反应结果 | 定性检测DNA的存在 | 定性检测RNA的存在 | 实时定量DNA拷贝数 | 实时定量RNA水平 |
| 应用场景 | 基因扩增、基因克隆 | 基因表达分析、病毒检测 | 基因拷贝数检测、病毒载量定量、突变检测 | 基因表达定量、RNA定量 |
总结
PCR 适合扩增DNA，定性检测目标序列的存在。
RT-PCR 则专门用于从RNA模板出发，检测RNA表达，属于定性分析。
qPCR 提供了实时定量DNA扩增的功能，适用于需要精确定量的实验。
qRT-PCR 将逆转录与实时定量结合起来，适合RNA基因表达的定量研究。
