成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统，特别是Cas12a和Cas13a，在其向导RNA（crRNA）的指导下，可以与目标核酸结合来触发其对周围单链核酸的非特异性高效切割，这被称为反式切割活性，从而通过对荧光报告探针的切割产生放大的检测信号。利用这一特性，CRISPR系统在分子诊断领域的应用已经取得了很大的进展。CRISPR-Cas12a系统通常被认为只能被单链或双链DNA来激活，尽管最近有研究表明RNA靶标也可以将其激活，但是高浓度RNA的激活要求，在高灵敏检测需求方面受到了很大的限制。众所周知，Cas12a系统的全长crRNA由保守的重复区RNA（rRNA）和可变的间隔区RNA（sRNA）组成。研究表明，将全长crRNA截断，分为单独的rRNA和sRNA（split crRNA），在靶标核酸存在的情况下，同样可以激活CRISPR-Cas12a系统的切割活性。根据这一特性，如果将Cas12a系统的sRNA与靶标DNA的角色互换，应当可以实现直接对RNA的高效分析。![]()
基于此，湖南师范大学熊二虎教授团队利用分裂式的crRNA开发了一种免扩增的RNA直接检测方法（Split crRNA-Motivated Amplification-free RNA Testing, SMART）（图1）。首先作者通过对rRNA的3'和5'端分别进行不同长度的延长来探究其对基于分裂式crRNA的Cas12a系统活性的影响（图2）。结果表明，尽管3'端延长的rRNA会对系统的活性造成抑制，但是5'端延长对系统活性的抑制更为明显。因此，SMART在短链RNA检测方面的效果要优于长链RNA，这是因为长链目标RNA与DNA激活子结合后所形成的单链RNA突出部分对Cas12a系统的活性产生了抑制。然而，尽管长链RNA对系统活性产生了一定影响，但是在无需额外预扩增或逆转录的情况下，SMART仍然可以直接检测低至fM水平的长链RNA，而对短链RNA的检测限可以达到aM水平。同时，SMART在区分不同种类miRNA方面也表现出色，具有优异的单核苷酸突变的鉴别能力。此外，研究人员通过将其与CRISPR-Cas13a系统联合，实现了多种RNA靶标的同时检测。总体而言，SMART是一种简单而强大的工具，可以灵活应用于各种RNA的检测中，并有潜力扩展到其他Cas12的同源物系统中。![]()
图2. 不同长度rRNA对SMART检测平台的活性影响探究该成果以“Split crRNA-motivated amplification-free RNA testing with CRISPR–Cas12a”为题，最新在线发表于Science China Chemistry上（doi: 10.1007/s11426-024-2241-1）。扫描二维码或点击左下角“阅读原文”可查阅全文。
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熊二虎，湖南师范大学“潇湘学者”特聘教授，硕士生导师，2018年毕业于湖南大学，获得理学博士学位。主要从事CRISPR系统分子诊断和纳米生物探针构建方面的研究。近年来以第一/通讯作者身份在Nat. Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Natl. Sci. Rev.、CCS Chem.、Sci. China Chem.、ACS Nano、Anal. Chem.等国际权威期刊上发表学术论文30余篇，其中热点论文2篇，ESI高被引论文5篇，论文总引用3000余次。【扩展阅读】
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